レンチウイルスベクタープラットフォームは、特にレンチウイルスベクターが大きな遺伝的挿入物に対応する能力のために、最も一般的なベクタープラットフォームよりも大きな利点を有する。したがって、レンチウイルスベクターは、アプリケーションで選択のプラットフォームになるだろうが、CRISPR / Casツールの配信を伴う。この技術は、障害が発生した場合に疾患に関連するα-シヌクレイン発現の自然調節機構を模倣する。
遺伝子発現の発現レベルと堅牢な変化を微調整することができます。私は、スクリーニングのために複数のガイドRNAを使用して、このまたは同様のアプローチを検証することを強くお勧めします。ガイドRNAの効力には大きなばらつきがあります。
それを決定する唯一の方法は、堅牢で包括的なスクリーニングと検証です。開発したシステムは、げっ歯類や非ヒト霊長類を含む動物モデルなどの他のモデルシステムに容易に適応することができる。これらのフォローアップ実験は、将来の臨床研究のための概念実証として役立つ可能性があります。
この手順を実証するのは、私の研究室の上級スタッフであるエカテリーナ・イリッヒ博士で、このプロジェクトに関連するレンチウイルスベクタープラスミドを作成するための分子クローニング手順の実行に焦点を当てます。彼女はまた、レンチウイルスベクター産生に関与する重要なステップを実証する。また、この手順を実証するのは、ヒトiPS細胞の病理学的関連細胞への分化に焦点を当てた私の研究室のポスドクであるリディア・タリアフィエロ博士です。
シヌクレインintron1のメチル化プロファイルを評価するためのアッセイの確立に関する重要なステップを実証します。私の研究室では、ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞の培養に焦点を当てたスタッフのアヒラ・スリスマンダ氏。まず、D-Cas9-DNMT3A-GFPから、ベクトルのDNMT3A部分を増幅して、DNMT3A触媒ドメインを開発する。
BAMH1制限酵素を用いてDNMT3A断片を消化した後。d-Cas9を運ぶ修飾PBK-301ベクターのBamH1サイトにクローニングし、直接サンガーシーケンシングによって検証し、純粋なマイセンレポーター遺伝子と得られたプラスミドをGFPダイジェストd-Cas9-DNMT3A-P2A純粋なマイセンおよびFSC1を有するプラスミドに置き換える。ゲル精製法を用いてベクター断片を精製する。
FSC-1でPBK-201を消化して挿入物を準備します。FSC 1 フラグメントをベクターに複製して、d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP を作成します。トランスフェクションのために0.2%ゼラチンで15センチメートルプレートをコーティングし、10分待ちます。
次にゼラチンを吸引し、22.5ミリリットルの高グルコース培地と2.5ミリリットルの以前培養したHEK-293T細胞懸濁液を加える。70~80%合流するまで5%CO2で37°Cでプレートをインキュベートします。115センチメートルのプレートに十分なプラスミド混合を調製するために、原稿に記載された4つのプラスミドを用いた。
プラスミドと同じ15ミリリットルチューブに塩化モル1モルの312.5マイクロリットルを加え、滅菌二重蒸留水を使用して最終体積を1.25ミリリットルにします。渦を出しながら、2つのX BBM溶液の1.25ミリリットルをチューブに軽く加えます。室温で30分間インキュベートします。
細胞から培地を吸引し、血清なしで調製した高グルコースDMEMの22.5ミリリットルを加える。各プレートに2.5ミリリットルのトランスフェクション混合物を加え、下地にドロップします。プレートを旋回し、インキュベーション後2〜3時間5%CO2で摂氏37度でインキュベートし、1皿あたり2.5ミリリットルの血清を加えて10%希釈を達成し、5%CO2で摂氏37度で一晩インキュベートします。
ウイルスを収穫するには、すべてのトランスフェクトされた細胞から上清を収集し、50ミリリットルの円錐管でそれらを引っ張ります。400~450gの遠心分離機を室温で10分間、上清を0.45マイクロメートル真空フィルターユニットで濾過します。次に、円錐状の超遠分管を準備してスクロース勾配を作成します。
各チューブの少なくとも4分の3を充填する各超遠心チューブの間でウイルス上清を均等に分配することにより、慎重に勾配に濾過上清を追加します。70000 g で摂氏17度で 2 時間遠心分離します。30%から60%のショ糖分をクリーンチューブに静かに集めると、冷たい1X PBSが100ミリリットルの総体積とピペットを複数回混ぜ合わせます。
各チューブに1X PBSに20%スクロースの4ミリリットルを慎重に加え、各チューブあたり約20〜25ミリリットルのウイルス溶液をピペット化してウイルス製剤を続ける層化する。慎重にチューブのバランスをとり、70000gで摂氏17度で2時間遠心分離します。残りの液体を慎重に吸引し、小さな半透明の斑点としてほとんど見えないペレットを含むウイルスを残してすべての液体を完全に除去する。
上清を空にした後、ペーパータオルのチューブを反転させて残りの液体を排出させます。1つ目のチューブに70マイクロリットルの1X PBSを加え、ピペットを十分に加え、ペレットを再懸濁します。サスペンションを次のチューブに移し、すべてのペレットが再懸濁されるまでピペット処理と移送を繰り返します。
1つ目のチューブに50マイクロリットルの1X PBSを加え、混ぜて洗浄します。次いで、懸濁液を第2のチューブに移し、洗浄を続け、洗浄を進め、以前のように移し、わずかに乳白色の最終懸濁液の約120マイクロリットルを得る。10000 gで60秒間遠心分離機を使用して、上澄み液を新しいチューブに移し、5マイクロリットルのアリコートを作り、MD NPCのクライオビアルを37°Cのヒートブロックに2分間置き、解凍した細胞を10ミリリットルのDME-F12で15ミリリットルの円錐形チューブに移します。
5分間300gで遠心分離機。上清を吸引し、2ミリリットルの完全なN2B2培地を温めた2ミリリットルで再懸濁する。N2B27の2ミリリットルを細胞懸濁液に加え、以前に調製した6つのウェルプレートをコード化したBMMの各ウェルに2ミリリットルの細胞をプレートする。
一晩で5%のCO2で摂氏37度で細胞をインキュベートします。MD NPCが70%合流している場合、レンチウイルスガイドRNA d-Cas9-DNMT3Aベクターを2マイクロリットル加えて、プレートをそっと旋回してトランスデューシングします。細胞を以前と同じ条件で16時間インキュベートした後、N2B27培地を48時間後に交換する。
M2B27を純マイセンのミリリットル当たり5マイクログラムで添加して安定したMD NPCラインを得て、N2B27+純粋マイセンで3週間細胞を増殖させ、SNCAイントロン1のメチル化プロファイルを特徴付ける。まず、DNA抽出キットを用いて各安定型トランスデューサ細胞株からDNAを抽出し、次に800ナノグラムのDNAを使用して市販キットでバイスルフィド変換を行い、次いでバイスルフィドを1マイクロリットル当たり20ナノグラムに変換した。パイロシーケンシング解析では、反応プレートをサーモサイクラーに転写し、PCRを開始する核フリーチューブでPCRマスターミックスを調製します。
アガロースゲル電気泳動に続く30と臭化物染色を用いて、2マイクロリットルのPCR産物を用いてアンプリコンを可視化します。パイロシーケンシングアッセイでは、原稿に記載されている硫化変換されたDNAおよびパイロシーケンシング試薬によってメチル化およびメチル化されていない混合物を使用した。レンチウイルスd-Cas9-DMMT3A-GFPベクターの物理的収量とこのプロトコルを使用して生成されたNaive GFPベクターの熱シーケンスソフトウェアを使用して、各CPGサイトのメチル化値を計算します。
これは、最適化されたベクターバックボーンと最適化された生産プロトコルを組み合わせることで、レンチウイルスd-Cas9-DNMT3 GFPベクターのCRISPR-dCas9ベクターのトランスダクション率がCRISPR d-Cas9-RNAの包装効率が低下したことを示唆する4倍の高い収率をもたらすことを示唆している。Naive PUROベクターのトランスダクション率は、d-Cas9-DNMT3Aベクターと比較して5倍高かった。これらの結果は、ナイーブGFPおよびd-Cas9-DNMT3A-GFPを用いてさらに確認された。
ここで説明する EB ベースのプロトコルは、MD NPC の差別化を可能にします。SNCAイントロン1におけるメチル化状態の定量化のために、7つのパイロシーケンシングアッセイが設計され、検証されました。
7つのアッセイはすべて検証され、線形相関を示し、検証されたアッセイを使用して、SNCA intron 1の23 CPGでメチル化レベルを決定することが可能であった1この手順に出席するよりも覚えておくべきことは、実験全体の一貫性を確保するために適切な成長と健康を示す細胞と協力することです。このプレゼンテーションで強調されたレンズ豆ベクターの生産は、インテグラル欠乏アンチウイルスの生産に容易に採用することができ、それはまた、より多くの量またはより濃縮されたベクターを生成するために簡単にスケールアップすることができます。この技術は、アルツハイマー病や関連する認知症を含む年齢関連や発生疾患に対する遺伝子調節解除の病原性影響を探求する道を開くことができる。
レンティルベクターがここで開発する利点は、それが危険ではないか、感染性レンズ豆ベクターは、彼らが遺伝子治療アプリケーションのための安全で信頼性の高い配信プラットフォームである細胞周期に最小限の効果しか持っていないということです。
