この方法は、生体内およびインビトロにおける正常な好中球の移動と、マウス関節炎モデルにおける病理学的好中球の浸潤を評価するために、よく使用される3つの方法を記述しようとする。この方法は、この分野の他の研究者にとって有用であると考えています。このプロトコルには、エアパウチアッセイおよびアジュバント誘発性関節炎を用いて炎症部位における好中球の移動能力を評価するための方法論的詳細が含まれています。
この技術の意味は、モデル群と治療群を比較することによって関節炎療法に向かって広がる。この方法は、炎症性疾患に関する洞察を提供し、炎症性腸疾患に適用することができる。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生である青平LuとHaixu Jiangです。
ゼロ日目にマウスを麻酔した後、5ミリリットルのシリンジに取り付けられた0.22ミクロンフィルターを使用して、3ミリリットルの滅菌空気を得る。麻酔マウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、皮下に3/8インチの針で26ゲージを使用して3ミリリットルの滅菌空気を注入します。治療後、マウスを呼吸単位から取り出し、よくセットされたケージに入れます。
マウスが動き始めるまで生きていることを確認するために、マウスを監視します。3日目には、以前に確立されたエアポケットに3ミリリットルの殺菌空気を注入して、エアポーチを維持します。6日目には、エアポーチに異なる治療を注入します。
陰性コントロールとしてPBSの1ミリリットルを注入し、局所炎症を誘発する陽性対照として、1ミリリットルLPSあたり1マイクログラムの1ミリリットルを注入する。6時間後、マウスを犠牲にする。各エアポーチに対して、1ミリリットルの洗浄バッファーを注入してエアポーチを洗浄し、15ミリリットルの遠心分離管に炎症性滲出液を回収します。
その後、2ミリリットルの洗浄バッファーでエアポーチを2回洗浄し、同じ遠心分離管に炎症性滲出液を採取します。室温で10分間100回gで遠心分離機。上清を捨て、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。
細胞を数えて、自動血液学分析装置を用いて好中球比を定量化します。少なくとも5秒間ボルテックスを行い、100マイクロリットルの懸濁液をインスリン注入器に引き込んで、完全なフロイントアジュバントを中断する。麻酔後、選択した足に印を付け、インジェクターから完全なフロイントアジュバントの20マイクロリットルを足首関節スペースの4つの垂直スポットに注入します。
処理されたマウスを新しいチャンバーに入れます。マウスを監視して、動く能力を取り戻すまで呼吸していることを確認します。3日ごとに、ポケット厚さゲージを使用して足首の関節直径を測定します。
また、関節炎のスコアリング基準によって関節炎の重症度を評価する。ゼロは正常です。紅斑や腫れの証拠はありません。
一つは、最も軽度の関節炎です。紅斑と軽度の腫脹は、タールサルまたは足首関節に限定される。2つは中等度の関節炎です。
足首から足骨まで伸びる紅斑と軽度の腫脹。3つは重度の関節炎です。足首から中足関節まで伸びる紅斑と中程度の腫脹。
4は最も重篤な関節炎です。紅斑と重度の腫脹は、四肢の足首、足、および数字、またはアンキローシスを包含する。マウスを犠牲にした後、後肢の皮膚と筋肉の一部をピンセットとハサミで取り除きます。
70%エタノールで関節をスプレーし、ペーパータオルを使用して残りの筋肉を取り除きます。足首関節を4%パラホルムアルデヒドで室温で2日間固定します。その後、関節を室温で1ヶ月間10%EDTAで脱灰し、毎週培地を変更します。
1ヶ月後、液体パラフィンの特定の量を持つマークされたカビに組織を約60°Cで入れて、組織を埋め込みます。簡単に冷やします。マイクロトームの厚さを4マイクロメートルに設定し、スライスをカットします。
その後、セクションを展開するために短い時間のために43度摂氏水浴でセクションを浮かべる。セクションをスライドに取り付け、スライドを摂氏70度で2時間オーブンに入れます。将来の使用のために、マイナス20°Cでスライドを保存します。
次に、スライドをラックに入れ、原稿に従ってキシレンとエタノールで洗水を行い、室温で水分補給します。最後に、水道水を3分間洗います。その後、0.1%の速い緑色の溶液を5分間汚します。
1%酢酸で10秒間リンスし、0.1%サフラニンO染色液で20分間染色します。その後、原稿に従ってキシレンおよびエタノール洗浄液にスライドを浸します。組織切片を物体のステージに取り付け、顕微鏡下で組織を観察します。
好中球を可視化するために、まずパラフィン切片を摂氏78度で2時間焼き上げて免疫ヒストリカル染色を行う。スライドをラックに入れ、原稿に従ってキシレン、エタノール、水、PBSを洗い、室温で水分補給します。その後、組織をカバーするためにパーメアビライゼーションバッファーの1滴を追加します。
湿度制御トレイに37°Cで10分間インキュベートします。その後、PBSでスライドを3回3回すすいでください。直接ティッシュをすすくのは避けてください。
次に、熱誘導抗原エピトープ検索を行う。スライドをラックに配置します。取り出しバッファーで満たされた圧力ボイラーにスライドを浸します。
電子レンジに圧力ボイラーを入れ、電子レンジを600ワットに設定し、スライドを10分間加熱します。沸騰後、ボイラーのスライドを90°Cまで冷却してください。スライドを取り出し、PBSで3分間3回すすいでください。
内因性ペルオキシダーゼ活性を焼起させるために、スライドを室温で15分間、作りたての過酸化水素3%に浸します。PBSで3分間スライドを3回すすいでください。疎水性ペンでサンプルの周りに大きな円を描きます。
サンプルに触れないようにしてください。サンプル50~100マイクロリットルの3%ウシ血清アルブミンを加え、サンプルを37°Cの湿度制御チャンバーに60分間ブロックして配置します。次に、ブロッキング ソリューションを削除します。
各セクションに50マイクロリットルのPBS希釈一次抗体を加えます。一晩摂氏4度で湿度制御トレイにスライドをインキュベートします。2日目にトレイを取り出し、室温で30分間放置します。
その後、PBSでスライドを3分間3回すすます。50マイクロリットルのPBS希釈二次抗体を組織に加える。37°Cで湿度制御トレイにスライドを30分間インキュベートします。
その後、PBSでスライドを3分間3回すすます。希釈DAB溶液を5分間開発します。DABの過剰反応によって引き起こされる暗い色の開発を避けてください。
蒸留水でスライドをすすいします。ヘマトキシリンのスライドに10秒間対抗し、スライドを水道水で5分間リンスします。酸アルコール超高速分化液を3秒間リンスし、水道水で10分間すすいでください。
原稿に従って、エタノールにスライドを浸し、室温でキシレンを洗います。取り付けソリューションでカバースリップを固定します。顕微鏡で組織を観察します。
本研究では、インビボでLPSによって刺激された好中球の採用を調べるエアパウチ実験を行った。空気パウチ滲出物の白血球サブセットは、コントロールよりもはるかに高かった。対照群と比較して、アジュバント誘発性関節炎群は足に有意な浮腫を示した。
足首の関節の直径が増加し、関節炎スコアが一貫して上昇しました。軟骨損傷は関節リウマチの代表的な症候群である。CFAの挑戦は、大量の白血球浸潤、著しい軟骨浸食、および滑膜過形成を誘発した。
任意の発現レベルにおけるMPOは、関節部において著しくアップレギュレートされた好中球浸潤の代表的なマーカーである。空気が皮膚に注入されていることを確認します, 筋肉にではなく、.また、抗p84を用いた関節組織切片の免疫組織化学的染色による好中球外トラップの形成を調べることができるか、これらの方法を用いて炎症性腸疾患などの他の炎症性疾患を研究することができる。
