好中球は末期分化細胞であり、現在好中球生物学を完全に再現する細胞株はない。したがって、生物学を研究するためには、純粋で不活性化された、健康で新鮮な好中球を得る必要があります。このリフレッシュ法は、密度勾配、沈下、穏やかな溶出を組み合わせて純粋な好中球製剤を得る。
それは簡単にセットアップでき、簡単な機器と少しの練習を必要とします。この方法のグラデーションレイヤーなどの技術的側面は、習得するためにいくつかの練習を必要としますが、グラデーションが完成したら、他のステップは簡単に来るはずです。まず、バフィーコート、パッケージング、ラミナーフードを殺菌します。
その後、血液の10ミリリットルを50ミリリットルのチューブに加えます。勾配のクリーナーのために血液を希釈するには、5%FBS / HBSSを追加し、最大35ミリリットルのボリュームをメイクアップします。蓋を閉じた後、チューブを数回反転して混合し、チューブを逆さまにして赤血球を欠いた底を得る。
血液の真下に密度勾配培地の10ミリリットルを加え、培地と血液が混ざらず、界面が鋭いままであることを確認します。400回gでチューブを室温で30分間回転させ、ブレーキを無効にしてください。紡糸後、上の血清血漿層に分離された勾配、末梢血単核細胞の中白環、曇密度勾配媒体層、および赤血球の上に白色の薄い好中球帯からなる底ペレットを観察する。
PBMCを除去するために、吸引ピペットをPBMC層に直接現れ、リンが除去されるにつれて血清プラズマ層が減少している間に完全に吸引する。PBMCの除去を最大にするために吸引ピペットでチューブの側面を削ります。PBMCリングと好中球/RBCペレットの間の曇密度勾配媒体層を慎重に除去します。
赤血球沈下の場合は、10ミリリットルのピペットを使用して好中球/RBCペレットをきれいなチューブに移します。その後、5%FBS/HBSSを最終体積25ミリリットルに加えます。3%デキストラン/0.9%NaClを含む25ミリリットルのプリウォーム溶液をチューブに直接加え、反転によって穏やかに混ぜます。
チューブを、15分間、レベル付けされた非振動面に置きます。チューブをフードに戻した後、ピペットを液体にわずかに浸し、液体表面を下方に続く上層の約30ミリリットルを集めます。チューブを回転させて、媒体に浮遊粒子を含まない赤いペレットを得る。
残存RBCのリシスについては、ペレットを破壊することなく上清を穏やかに吸引する。チューブに25ミリメートルの無菌超純水を直接加え、チューブを28秒間反転して穏やかに混ぜます。その後、すぐにチューブに水で調製滅菌1.8%NaCl溶液の25ミリリットルを追加し、穏やかな混合によって等張条件に溶液を戻します。
低ブレーキで200倍gでチューブを3〜5分間回転させ、好中球を用いたRBCおよび血小板の沈下を最小限に抑えます。白い好中球ペレットを再懸濁させる場合は、ペレットに培養培地を直接添加するが、ピペットは上下に加えない。次に、チューブを左右に水平に揺らし、細胞の活性化を最小限に抑えます。
細胞凝集または凝集が観察された場合は、70マイクロメートルのメッシュを介して細胞懸濁液を濾過し、塊状の好中球を捨てます。単離中性球製剤の品質を評価するために、好中球、好酸球、および活性化マーカーに特異的なマーカーを用いて細胞を染色する。フローサイトメトリーにより20,000個の細胞を獲得した後、gating戦略を用いて細胞の純度と活性化を分析し、テキスト原稿に記載されているように、アネキシンV/プロピジウムヨウ化物を用いて細胞生存率を決定する。
低速の密度勾配は、より純度の高い好中球を生み出し、一方、高速は純度を犠牲にして収率を増加させた。蛍光活性化細胞選別を用いて、細胞分布だけでは細胞分離の質の推定値を提供したが、特定の細胞マーカーの使用が好ましい。同定された汚染細胞集団は、単球、リンパ球、好酸球であった。
巨大な好中球の収量は、このプロトコルを使用して達成された。CD62Lの発現を評価した。CD62Lの平均蛍光強度は陽性対照細胞において減少し、CD62L脱落および好中球活性化を示す。
好中球の健康状態は、好中球が比較的短い半減期を有し、活性化が生命をさらに短くするので、アッセイを行う前に評価されるべきである。密度勾配および市販マイクロビーズを用いた好中球精製後、細胞を24時間培養し、細胞生存率をフローサイトメトリーで解析した。生存細胞の定量化により、密度勾配精製はキットを用いた精製よりも24時間後により多くの生存細胞をもたらしたことが示された。
勾配の層化および遠心分離のステップは、準備の品質に大きな影響を与えるため、可能な限り行うことが重要です。インビトロ実験および生化学的アッセイは、この手順に従って行うことができる。また、サイトカインやタンパク質発現実験のように超純粋な細胞が必要な場合にも、陰性選択を行うことができます。
