この方法は、動的化学勾配をナビゲートする微生物の微小な生態学と行動を解明し、生態学的に関連する微環境における隠されたトレードオフ、栄養素運動学、および集団ダイナミクスを明らかにすることを可能にする。マイクロ流体技術と光起液を組み合わせることで、局所的な化学誘引物質がマイクロスケールで突然入手可能になる制御された化学パルスを生成し、最初に不安定な化学勾配にさらされた微生物集団の化学戦術応答を測定します。CADソフトウェアを使用してチャンネルを設計し、透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します。
原稿によると、クリーンルームで柔らかいリソグラフィによってマスターを製造します。エラストマーと硬化剤を40ミリリットルビーカーで10対1の比率で組み合わせてPDMS混合物を調製します。プラスチックナイフで、液体が均質になるまで激しく混ぜます。
PDMS混合物を真空チャンバー内で室温で45分間すぐに脱気する。プロセスを迅速化するには、インターフェイスで形成される気泡を破裂させるために、定期的に真空を解放します。加圧クリーナーでマスターの表面からほこりを取り除きます。
その後、脱ガスPDMS混合物をマスターに注ぎ、オーブンで80°Cで2時間焼きます。約5ミリメートルの距離で微細構造の周りにブレードでPDMSをカットし、慎重にマスターからPDMSを剥がします。マイクロチャネルの入口および出口として機能するパンチ穴。
マイクロチャネルを粘着テープで密封して、ほこりの蓄積を防ぎます。3D デザイン ソフトウェアを使用して 3D 形状を設計し、高解像度の 3D プリンタで PDMS 金型のマスタ シェイプを印刷します。前に行ったようにPDMS混合物を調製し、脱気した後、粘着テープで手を出すことによってマスターの表面をきれいにします。
マスターをスケールに入れてください。次に、マスターの中央領域を避けながら、0.5ミリメートルでマスターの高さを一致させることによってPDMSの所望の高さを得るために、未硬化PDMS混合物の23.4グラムを注ぎます。圧縮空気の助けを借りて残りの気泡を取り除く。
少なくとも12時間焼くために摂氏45度でオーブンでマスターに投げられたPDMSキャストを置きます。次に、硬化PDMS層を軽く剥がし、細菌懸濁液の注入のために入口及び出口穴をパンチする。ペトリ皿の表面とPDMS型の両方を酸素プラズマで2分間活性化します。
ペトリ皿にそっと押して、ペトリ皿にPDMS型を接着します。フィーチャが配置されている場所を押すのは避けてください。ケミカルボンドを強化するために、45°CのオーブンでPDMS 3D金型に結合したペトリ皿を少なくとも12時間置きます。
次に、酸素プラズマチャンバー内のナノ多孔性ポリカーボネート膜を室温で1分間活性化する。化学フードの下で、ポリプロピレンチューブを使用して、脱イオン水中の3-アミノプロピルトリエトキシシランの市販溶液を1体積%に希釈します。希釈した3-アミノプロピルトリエトキシシラン溶液をペトリ皿に移し、活性化膜を3-アミノプロピルトリエトキシシラン溶液に20分間浸漬する。
次いで、ピンセットを用いて3-アミノプロピルトリエトキシシラン溶液から膜を取り出し、クリーンルームの上に拭いて乾燥させた。膜上に横たわるPDMSマイクロ流体チャネルの製造のために、細菌のアリーナの洗浄を可能にし、前に行われた単一の化学パルス実験のためのマイクロ流体デバイスの製造を繰り返す。PDMS洗浄チャネルを機能化膜に結合させるために、まずPDMS洗浄チャネルとポリカーボネート膜の両方を酸素プラズマチャンバーで2分間活性化する。
プラズマ処理の直後に、PDMS洗浄チャネルを膜上に静かに押し込んで機能性膜とPDMS洗浄チャネルを接触させます。PDMSと膜を穏やかに押し合うことが重要であり、または膜が200マイクロメートルの高さのPDMSマイクロチャネルの天井に不可逆的に結合する可能性があります。次いで、結合したラミネートPDMS洗浄チャネルポリカーボネート膜と3D PDMS型の両方を、酸素プラズマチャンバーに2分間入れることで、ペトリ皿に結合した3D PDMS型の両方を活性化する。
2つのPDMS層の間に膜を挟み、一緒に押します。ペトリ皿をサンドイッチ構造に結合し、少なくとも12時間は摂氏45度のオーブンに入れ、化学結合を強化します。まず、20分間真空下でミリ流体室を維持します。
次に、ミリ流体室を含むペトリ皿を顕微鏡ステージに置きます。ピペットで、人工海水中の1ミリモル4-メトキシ-7-ニトロインドリニルケージL-グルタミン酸溶液中のGFP蛍光ビブリオオルダリの希薄な細菌懸濁液で膜の下のチャンバーを満たします。チャネルに細菌懸濁液を充填した後、ペーパータオルで溶液を過剰に吸い込み、入口と出口をPDMSプラグで密封し、穴にそっと押し込みます。
注射器に1ミリモル4-メトキシ-7-ニトロインドリニルケージL-グルタミン酸の人工海水溶液を充填し、膜上の洗浄チャネルの入口および出口にチューブを取り付けます。チューブを廃棄物貯留層に接続し、チューブが完全に流体廃棄物貯蔵所に沈み、圧力振動を避けるようにします。シリンジポンプの流量を毎分50マイクロリットルに設定します。
シリンジポンプを起動して、膜上の洗浄チャネルの流れを確立します。LEDビームと顕微鏡ステージを制御するソフトウェアを起動し、異なる場所で、異なる強度でユーザー定義のパルスシーケンスを生成します。数時間の期間にわたって一定の時間間隔で、大きなサーフェスをカバーするために複数の連続した場所にわたって 4 倍の目標を使用してビデオを録画します。
本研究では、微小流体およびミリ流体デバイスを使用して、動的栄養条件下での細菌化学戦術応答および蓄積プロファイルを研究した。最大強度投影法は、パルス放出直後の0.5秒間隔およびパルス放出後40秒の間に、白色の痕跡で示される細菌の位置を示す。細菌の軌跡は、パルス放出後60秒で示した。
シェーディングされた領域は、視野の中央で0秒の時点で光起によって放出される化学パルスを表し、その後拡散した。細菌濃度と、視野の中心におけるパルス放出後の放射状ドリフト速度の時間的ダイナミクスをここに示す。ドリフト速度の負の値は、パルスの中心に向かって指示された化学戦術運動に対応します。
化学的勾配がない場合の細菌集団に関する水泳統計がここで提示される。軌道は、マイクロチャネルにおける3次元細菌運動の2次元突起を表す。測定された細菌の泳ぐ速度の確率分布はガンマ分布によって適合した。
細菌軌跡から、連続した方向転換間の確率分布を抽出した。再配向パターン、泳泳速度の分布、および生物の方向転換統計を使用して、個々のモデルに通知しました。この方法は、アミノ酸グルタミン酸に向かって走気性を行う海洋細菌ビブリオオルダリについて試験されているが、提案された方法論は、種および化学誘引物質の異なる組み合わせ、ならびに空間的に不均一で動的な条件下での集団およびコミュニティダイナミクスのような化学軸を超えた生物学的プロセスに広く適用可能である。
バッチ培養やチェモストの成長など、微生物生態学や微生物学における古典的な技術は、微生物生息地の時空間的特徴をほとんど無視してきた。光起彩によるマイクロスケールでの化学パルスのほぼ瞬時の作成は、海洋細菌が野生で遭遇する栄養パルスの種類を、例えば、沈む有機粒子の背後にあるプルームの拡散や、リセドフィトプランクトン細胞から広がる栄養素を再現することを目的としています。アミノシラン溶液は、急性毒性であり、細心の注意を払って処理する必要があります.
私たちはフームフードの下で独占的に働き、ラボコート、安全ゴーグル、手袋などの保護具を着用しています。また、発生した廃棄物の処理も行っています。
