この研究は、統合バイオシステム研究と教育のためのヴァンダービルト大学（VIIBRE）によって、およびサールシステムバイオロジーとバイオエンジニアリング学部研究経験（サールSyBBURE）で、国立科学財団から＃0649883助成金によって支えられている。

I.マイクロ流体デバイスの作製<ol><li>マイクロ流体デバイスを作成する最初のステップは、コンピュータ支援図面（CAD）プログラムで、デバイスの2次元レイアウトを描画することです。このようなCleWinまたはFreehand、CorelDRAWーなどの、私たちはAutoCADを使用しているが、他の描画プログラムもご用意しています。 </li><li>次のステップは、フォトリソグラフィマスクを製造することです。デバイスの寸法、必要な分解​​能と予算に応じて、これらのマスクは直接、高解像度のプリンタを使用してオーバーヘッドが透明に写真フィルム上に作成された、あるいは印刷された、クロム（最高解像度、高コスト）で作製することができます。ここでは、アドバンス模本（株）、マサチューセッツ州ノースアンドーバー製のCrマスクを使用している。 </li><li>次のステップは発生レリーフ型を作成するために感光性エポキシの上にマスクからパターンを転送することです。 <ol><li>最初に、負のSU8フォトレジストの層が所望の厚さのシリコンウエハー上にスピンし、過剰の溶媒を揮発させる焼成する。フォトレジスト製剤およびスピン速度は堆積層の厚さを制御します。 </li><li>その後、パターンは、マスクを通してUV光の予め決められた用量にさらされています。ポスト露光ベーク架橋それらを不溶性フォトレジストコーティングの光にさらされる領域を、。 </li><li>次は、未露光レジスト開発のステップは、正の発生レリーフ構造マスターと呼ばれるがままに、化学物質の開発者で除去されています。 </li><li>第三ベーキングステップは、ハードベーク工程は、さらに構造を修正するためのオプションと呼ばれる。 </li></ol></li><li> PDMSモールド<ol><li>我々は、マイクロ流体デバイス1のレプリカの成形用のシリコーンエラストマー、ポリ（ジメチルシロキサン）を使用してください。最初に、基材は、硬化剤で10:1の重量比で混合し、このようなペトリ皿などの浅い容器にカビに注ぎ、そしてすべての目に見える泡がなくなるまで、真空下で脱気する。 </li><li>未硬化PDMSとマスターを65で4時間以上のために慎重に水平にオーブンで発生するポリマーの架橋のためのCに配置されます。 </li><li> PDMSを固化された後、成形されたセクションは、ペトリ皿から切り出しています。穴が完成したデバイスのマイクロ流体空間をアクセスするために、デバイスの上部からパンチされています。 </li></ol></li><li>ガラスへの添付<ol><li>クリーンPDMSは、不可逆的に酸素プラズマに暴露することによりガラスをきれいに接着されている。最初に、成形し、パンチPDMSときれいなガラスのスライドは、プラズマクリーナーに接着面を上に配置されます。我々は、PDC - 32G Harrickプラズマクリーナーを使用。 </li><li>チャンバーを閉じた後、オペレータは、無線周波数またはRFソースして真空ポンプをオンにして。プラズマは、自己室でわずかに紫色の輝きによって明らかなように、チャンバ内に点火されます。 </li><li> 30秒間プラズマに暴露した後、RF信号源とし、真空ポンプがオフになっています。 </li><li>迅速に、スライドガラスとPDMS装置は、チャンバーから取り外し、直接接触（ダウン成形PDMSの表面側）に取り込まれます。これは不可逆的な結合を形成し、また、表面特性を親水性になります。 </li><li>必要に応じて、異なる表面化学を吸着または共有結合によって表面上のタンパク質の固定化によってPDMSを達成することができます。 </li><li>デバイスは、その後脱イオン水、増殖培地、または毛管力や注射器を持つ穏やかな圧力を使用することにより、人工的な地下水などの流体を充填することができる。 </li></ol></li></ol> II。重量分析によるマイクロ流体デバイスのフローの定量化<ol><li>デバイス内の圧力駆動流のキャリブレーションを行うには、微細構造のフローセルは、最初にDI水でプリロードされた。 </li><li>このようなプラスチック製注射器またはフローモジュールとして液体を含むリザーバは、（図1に示す）も上流の吸気口に接続されていて、貯水池内の流体の高さは十分下流での高さ以上に維持される。 </li><li>サンプルは定期的にも廃棄物を回収し、化学天秤で秤量する。 </li><li>合計時間と合計量をプロットする曲線の傾きは、平均体積流量（図2）を与える。我々は、圧力ヘッドの幅広いと異なる圧力維持システムのための再現性、線形平均速度を発見した。 </li></ol> III。流れの可視化、速度のマッピング、および疎水性/親水性相互作用<ol><li>モデルのキャリブレーションの場合は、両方カルボキシYGと平野YG表面に3μmの蛍光ラテックスビーズはPolysciences社から入手した、0.01％の固形分の濃度に純水で希釈した。 </li><li>生息地を流れるビーズはMightex BCE - B013 - Uモノクロカメラを搭載したツァイスAxiovert 25蛍光顕微鏡で可視化した。 </li><li>個々のフレームは、矢継ぎ早に取り込まれ、ImageJのソフトウェアパッケージ（図3）と映画に組み立てられた。 </li></ol> IV。細菌の増殖とトランスポートのモデリングのためのマイクロ流体デバイス（EcoChip） <ol><li> ビブリオ 。 GFP館は、非病原性緑色蛍光タンパク質を発現する生物は約10 9細胞/ mlの濃度にルリア-ベルターニ培地で14時間増殖させた。 </li><li>増殖培地中の細菌は、EcoChipデバイスに導入し、デバイスを植民地化し、19時間一晩フロックと映画を確立させた。 </li><li>その後、増殖培地をウェルから除去し、生息地のすべては、細菌の密度が異なるが、異なる生息地に残っていたように（ASWのレシピのためにWangら2を参照してください）人工海水でフラッシュした。 </li><li>遅い流れの条件を3他の生息地内で維持されたまま一生息地は、フロー制御なしで密閉保管した。 </li><li>細菌増殖の蛍光灯や白色光の画像は数日の期間（図4）ごとに15〜20時間を取られました。 </li></ol> V.代表の結果フローモジュールは、複数の生息地を介してフローを規制し、配布するための簡単​​な手段を提供します。重量分析は、生息地と、入力と出力の井戸との間の圧力差の油圧抵抗に依存して生息地の構造、フロースルー率を決定するために簡単で直接的な方法であることが判明した。ビーズ流動実験のために我々はuncarboxylatedビーズ（図2）については、デバイスの面ではるかに大きいビーズ蓄積を観察している。さらに、大径のビーズ、6と10 mmは、はるかに小さい孔の開口部に運びとなり、デバイスに蓄積し始める可能性が高かった。速い流速は粒子保持と同調して減少。 細菌増殖の実験中に、流れの条件の影響は明らかである。連続的な剪断力は、細菌が一緒に集約し、フォームのフロックの原因、および個々の細胞として記載されていない。大規模な細菌フロックの輸送は、巨視的な系で勉強することは極めて困難である重要な環境プロセスです。 <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。フローモジュールの機能と動作を示す回路図。 <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。異なるカラムの高さの重量分析により決定される構造化された生息地を通過する流れの速度。列の高さの比率：60 / 40 = 1.5、決定した流量比：1.04 / 0.71 = 1.46。 H = 40 mmの結果、流速はV = 0.71μL/分であり、Hのために= 60 mmはV = 1.04、μL / minです。推定平均線速度3.1 mm / sにし、それぞれ4.6 mm / sになります。 <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig3.jpg" alt="図3" /> 図3とし、カルボキシル化は、構造化された生息地を流れることなく、3umラテックスビーズの輸送。 <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。細菌の増殖と遅い流れの存在下で種の密度の関数としてのバイオフィルム形成の変化。

<ol>
	<li>Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+protozoa+through+narrow+channels.">Mobility of protozoa through narrow channels.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).</li></ol>

EcoChipシステムは、個々の実験のニーズに適応可能です。新しいマスターは、比較的容易に作成することができます、とマスターが作製されれば、必要に応じて、追加の正確に複製されたデバイスは、キャストすることができます。フローモジュールは、使用が簡単で、特別な装置や複雑な接続を必要とせず、シンプルな立ちヘッド圧力駆動流のシステムとしてモデル化することができます?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SU8-2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

window on a microworld: simple microfluidic systems for studying microbial transport in porous media

多孔質媒体中の微生物の増殖とトランスポートは、地下水および地表水、環境での栄養素のリサイクルだけでなく、直接のための飲料水に病原体の伝播の品質にとって重要な意味を持っている。天然多孔質媒体は複雑な物理トポロジ、様々な表面化学、栄養素と電子受容体の動的な勾配、および微生物の斑状分布で構成されています。これらの機能は、解釈が難しい微生物移動のマクロスケールの調査の結果を作る、ミクロンの長さスケールにより大きく変化すること、および機構モデルの検証は困難。ここでは、シンプルなマイクロ流体デバイスは、微細構造の生息地、微生物の相互作用を可視化するために観測された現象に影響を与える主要なプロセスを識別するために、そして体系的に予測モデルを検証するために使用することができる方法を示します。シンプルで使いやすいフローの細胞が透明な、生体適合性と酸素透過性材料ポリ（ジメチルシロキサン）で作られました。フォトリソグラフィーの標準的な方法は、微細構造のマスターを作るために使用され、レプリカの成形は、マスターから微細構造フローセ​​ルをキャストするために使用されました。フローセル室の物理的な設計は、実験的な要件に適応できる：マイクロチャネルは、単純な線形の接続から、複雑に変化することが2μmと小さいフィーチャサイズとトポロジ。私たちのモジュラーEcoChipフローセル配列は、重力駆動型フローモジュールで同一のチャンバーとフロー制御の数十しています。我々は、表面化学、流体特性、または微生物集団の特性の影響を調査している間EcoChipデバイスを使用することで、物理的な構造と圧力ヘッドは一定に保たまたは体系的に変えることができることを示している。非病原性を用いた輸送実験を通じ、緑の蛍光タンパク質発現<em&gt;ビブリオ</em&gt;細菌株、我々は、生息地の構造、フローの条件、および基本的な輸送現象に関するinoculumsのサイズの重要性を示し、そしてリアルタイムの粒子スケールの観測と、マイクロフルイディクスは、隠された世界の魅力的なビューを提供することを示している。

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Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

マイクロ流体デバイスは、リアルタイムでかつ適切な物理的なスケールで複雑な自然のプロセスを可視化するために使用することができます。我々は地下で細菌の増殖と輸送を研究するための自​​然な多孔質媒体の主要な機能を模倣する簡単なマイクロ流体デバイスを開発しました。

多孔質媒体中の微生物トランスポート研究のためのシンプルなマイクロ流体システム：マイクロワールドでのウィンドウ

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.7K ビュー.  Vanderbilt University. マイクロ流体デバイスは、リアルタイムでかつ適切な物理的なスケールで複雑な自然のプロセスを可視化するために使用することができます。我々は地下で細菌の増殖と輸送を研究するための自​​然な多孔質媒体の主要な機能を模倣する簡単なマイクロ流体デバイスを開発しました。

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

生物学

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

診断ツールを開発するマイクロエレクト​​ロメカニカルシステム（MEMS）の使用

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

微生物システム生物学のケモスタットの使用

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.