3D多色DNA FISHは、保存された核内の複数のゲノム座を可視化し、相互相互作用と局在化を単一細胞レベルであいまいに定義することを可能にする。3D多色DNA FISHは核建築の直接調査を可能にする。一般に、染色体キャプチャベースの技術と連携して動作し、この技術を単一セル内のCデータ検証用のツールとして利用できます。
手順を実証することはフェデリカ・マラスカになります。彼女は私の研究室のポスドクです。開始DNA材料の長さに応じて摂氏16度の熱ミキサーでニック翻訳ミックスをインキュベートすることから始めます。
インキュベーションの終わりに、2.2%のアガロースゲルでプローブのサイズを確認します。DNA FISH実験ごとに、150マイクロリットルの二重蒸留水でプローブを製造した出発DNA材料、標識されていないサケ精子DNA20マイクログラム、種特異的なコット1DNAの3.5マイクログラム、100%エタノールの3つの体積、および1時間から1/10モル酢酸ナトリウムの1/10体積に応じて適切な量のプローブを沈殿させる。インキュベーションの終わりに、摂氏4度で1時間、最高速度でサンプルを遠心分離します。
上清を捨て、ペレットを70%エタノールの500マイクロリットルで2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを100%ホルムアミドの2マイクロリットルに再び懸濁し、プローブを摂氏40度で30分間振ってから、20%デキストラン硫酸塩にクエン酸4倍のクエン酸ナトリウムを等量加えます。小さな核と少量の細胞質を持つ小さな細胞の固定前処理と透過性については、まずPBSの200マイクロリットルの6番目の細胞に2倍の10を24ウェルプレートの個々のウェルのガラスカバーリップに直接加え、細胞が室温で30分間落ち着くようにします。
インキュベーションの終了時に、PBSを300マイクロリットルの新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを0.1%Tween 20で補います。10分後、固定細胞を0.05%TPBSの300マイクロリットルで室温で5分間洗浄します。最後の洗浄後、室温で10分間0.5%TPBSの300マイクロリットルでT細胞を透過させ、37°CでPBSで1時間希釈したRNAAseカクテルのウェルあたり250マイクロリットルで細胞を処理します。
インキュベーションの終わりに、PBSの300マイクロリットルで細胞をすすい、4°Cで一晩インキュベーションで各井戸にPBSで20%グリセロールの300マイクロリットルを追加します。翌朝、ガラスをドライアイスの上に15〜30秒間置いて細胞を凍結させ、サンプルを室温で徐々に解凍し、PBSで300マイクロリットルの20%グリセロールに30秒間浸漬します。ちょうど実証したように細胞を3回凍結/解凍した後、室温で5分間0.5%TPBSの300マイクロリットルでサンプルを洗浄し、続いて室温で5分間0.05%TPBSの300マイクロリットルで2回洗浄します。
最後の洗浄後、通常の塩酸を300マイクロリットルの0.1で室温で12分間処理し、続いて300マイクロリットルのクエン酸生理食塩水ナトリウムで2リンスを処理します。その後、室温でクエン酸2X生理食塩水ナトリウムに50%ホルムアミドの300マイクロリットルで一晩サンプルを固定します。固定のために、細胞質の高い量の大細胞の前処理および透過性は、ヒト初等T細胞に対して示されているように細胞を固定し、前処理し、透過し、0.01通常の塩酸中の0.0025%ペプシンの300マイクロリットルで0.0025%ペプシンを0.01秒から5分間治療する。
光学顕微鏡下で細胞を観察し、核が細胞質から解放されるとすぐに50ミリモル塩化マグネシウムの300マイクロリットルで2回の5分間のスケで反応を止めるが、核子は依然として見えてそのままである。3D多色DNA FISHの場合、ハイブリダイゼーションプローブを摂氏80度で5分間変性させ、すぐにプローブを氷の上に置きます。プローブをクリーンな顕微鏡スライドに積み込み、細胞のカバースリップをプローブの各ドロップに1つ置きます。
カバースリップの縁をゴムセメントで密封します。セメントが完全に乾燥したら、75°Cの加熱ブロックでサンプルを変性させます。4分後、水浴に浮かぶ金属製の箱の中で一晩摂氏37度でサンプルを水分補給します。
翌朝、ゴムセメントを剥がし、スライドを2X生理塩水ナトリウムに浸してカバースリップを慎重に持ち上げます。各カバースリップを、1回あたり2ミリリットルの新鮮な生理食塩水ナトリウムクエン酸を含む6ウェルプレートの個々の井戸に入れ、毎分90回転で揺れ動かして摂氏37度で2回の5分間の打ち打ちを行います。インキュベーションの終わりに、4X生理食塩水ナトリウムクエン酸で0.2%Tween 20の2ミリリットルでカバーリップを短時間すすぎます。
3D多色DNA FISH検出の場合、カバーリップを新しい24ウェルプレートの個々の井戸に移し、300マイクロリットルのブロッキングバッファ内の非特異的結合を摂氏37度で20分、毎分20回転でブロックします。インキュベーションの終わりに、37°Cの暗くて湿ったチャンバーで35分間ブロッキングバッファに希釈された抗ジゴキシゲニンおよび/またはストレプトアビジンの適切な濃度でサンプルを扱います。インキュベーションの終わりに、サンプルを6ウェルプレートの個々の井戸に移し、0.2%Tween 20と4X生理食塩水ナトリウムを1回5分間、毎分90回転で振って2ミリリットルでサンプルを3回洗浄します。
最後の洗浄の後、PBSの2ミリリットルでサンプルを平衡化してから、カバーリップを新しい24ウェルプレートに移し、PBSで2%ホルムアルデヒドを300マイクロリットルで2%ホルムアルデヒドを室温で2分間固定します。固定細胞をPBSの300マイクロリットルで5回短時間洗浄し、続いて室温で5分間PBSの300マイクロリットルで1ミリリットル当たり1ナノグラムで希釈したDAPIで染色する。PBSでさらに5回カバーリップを洗い、適切な取り付け媒体でサンプルを取り付けます。
その後、顕微鏡システムで3D画像を取得します。3D多色DNA FISHは保存された3D核の中で異なったゲノムのlociの現代的な視覚化を可能にする。DNAプローブ調製の場合、200塩基対未満のプローブサイズは、3D多色DNA FISHの手順を成功させます。
ニック翻訳によって生成される最適でないDNA FISHプローブは、部分的または過剰に消化され得る。オーバー消化プローブは、ハイブリダイゼーションの特異性の喪失と結果的に背景の増加のために非特異的な信号をもたらす。ヒトの初等Tリンパ球および小さな核と細胞質の少ない細胞の場合、DNAプローブへの核のアクセスを促進し、核の完全性を維持するために、12分間0.1の正常な塩酸処理が推奨されます。
細胞質ペプシン消化は、小細胞でのDNA FISH良いシグナルを得るために必要とされない。しかし、ヒトの原発性筋芽細胞や細胞質が豊富な細胞にとって、ペプシニンゼーションの工程は基本的なものです。短く、最適でない細胞骨格ペプシニンゼーションは、DNA FISHシグナルの不在で終わる核へのプローブの侵入を妨げる。
しかし、細胞がペプシン化を超えている場合、核は3D構造を失ったままではありません。成功した 3D 多色 DNA FISH は、核内のシグナルの存在になります。私は新鮮な生物学的材料を使用して、3D多色DNA FISHを実行する前にプローブをテストし、新鮮な溶液を準備し、インキュベーション時間と温度を正確に行くことをお勧めします。
formamideおよびHCLは有害物質であり、適切な使い捨て材料を含む化学ヒュームフードで常に使用する必要があることを覚えておいてください。
