3D רב צבעי DNA FISH מאפשר הדמיה של לוקוסים גנומיים מרובים בתוך גרעינים משומרים להגדיר באופן עמימות האינטראקציה ההדדית שלהם לוקליזציה ברמת תא יחיד. 3D רב צבע DNA דגים מאפשר חקירה ישירה של הארכיטקטורה הגרעינית. באופן כללי, היא פועלת בשילוב עם טכנולוגיות מבוססות לכידת כרומוזום מה שהופך את הטכניקה לכלי זמין לאימות נתוני C בתוך תאים בודדים.
הפגנת ההליך תהיה פדריקה מרסקה. היא פוסט-דוק במעבדה שלי. התחל על ידי דגירה של תערובת תרגום ניק במיקסר תרמי ב 16 מעלות צלזיוס על פי אורך חומר ה- DNA ההתחלתי.
בסוף הדגירה, לבדוק את גודל הבדיקות על 2.2% ג'ל אגרוז. עבור כל ניסוי DNA FISH, לזרז את הכמות המתאימה של בדיקה על פי חומר ה-DNA ההתחלתי שממנו הבדיקות יוצרו ב 150 microliters של מים מזוקקים כפולים, 20 מיקרוגרם של דנ"א זרע סלמון ללא תריס, 3.5 מיקרוגרם של דנ"א ספציפי של מינים, שלושה כרכים של 100%אתנול, ונפח 1/10 של שלושה נתרן אצטט טוחן במשך שעה אחת במינוס 80 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה המדגם במהירות מקסימלית במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 microliters של 70% אתנול. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על גלולה בשני מיקרוליטרים של 100% formamide ולנער את הגשוש במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס לפני הוספת נפח שווה של 4X מלוחים נתרן ציטראט ב 20%dextran סולפט. עבור קיבעון טרום טיפול ו permeabilization של תאים קטנים עם גרעינים קטנים כמות נמוכה של ציטופלסמה, תחילה להוסיף פעמיים 10 לתאים השישית ב 200 microliters של PBS ישירות על כיסויי זכוכית בארות בודדות של צלחת 24 היטב ולאפשר לתאים להתיישב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, החלף במהירות את ה-PBS ב-300 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד טריים בתוספת 0.1%Tween 20. לאחר 10 דקות, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים ב 300 microliters של 0.05% TPBS במשך חמש דקות לשטוף בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל לתאי T עם 300 microliters של 0.5% TPBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הטיפול בתאים עם 250 microliters לכל באר של קוקטייל RNAse מדולל 1:100 ב PBS במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, שוטפים את התאים ב-300 מיקרוליטרים של PBS ומוסיפים 300 מיקרוליטרים של 20% גליצרול ב-PBS לכל באר עם דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, מניחים את הזכוכית על קרח יבש במשך 15 עד 30 שניות כדי להקפיא את התאים לפני הפשרה הדרגתית של הדגימות בטמפרטורת החדר והשרייתם ב-300 מיקרוליטרים של 20% גליצרול ב-PBS למשך 30 שניות. לאחר הקפאה/הפשרה של התאים שלוש פעמים נוספות כפי שהודגם זה בלבד, לשטוף את הדגימות 300 microliters של 0.5% TPBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שתי שטיפות ב 300 microliters של 0.05% TPBS במשך חמש דקות לשטוף בטמפרטורת החדר.
לאחר הכביסה האחרונה, לטפל בתאים עם 300 microliters של 0.1 חומצה הידרוכלורית נורמלית במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שתי שטיפות ב 300 microliters של נתרן ציטראט מלוחים. לאחר מכן לתקן את הדגימות לילה 300 microliters של 50% formamide ב 2X מלוחים נתרן ציטראט בטמפרטורת החדר. עבור קיבעון, טרום טיפול ו permeabilization של תאים גדולים עם כמות גבוהה של ציטופלסמה, לתקן, טרום טיפול ו permeabilize התאים בדומה כפי שהוכח עבור תאי T ראשוניים אנושיים ולטפל בדגימות עם 300 microliters של 0.0025%pepsin ב 0.01 חומצה הידרוכלורית נורמלית במשך כמה שניות עד חמש דקות.
שימו לב לתאים תחת מיקרוסקופ אופטי ועצרו את התגובה עם שתי שטיפות של חמש דקות ב-300 מיקרוליטרים של מגנזיום כלוריד 50 מילימולרי ברגע שהגרעין חופשי מהציטופלסמה אך הגרעינים עדיין נראים ושלם. עבור 3D רב צבעי DNA דגים, denature בדיקות הכלאה ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ומיד למקם את הבדיקות על קרח. טען את הבדיקות על שקופית מיקרוסקופ נקייה והצב קו כיסוי אחד של תאים על כל טיפת בדיקה.
לאטום את הקצוות כיסוי עם מלט גומי. כאשר המלט התייבש לחלוטין, denature את הדגימות על בלוק חימום 75 מעלות צלזיוס. לאחר ארבע דקות, מייבשים את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בקופסה מתכתית הצפה באמבט מים.
למחרת בבוקר, לקלף את מלט גומי עם שקופיות שקוע 2X מלוחים נתרן ציטראט בזהירות להרים את כיסויים. מניחים כל כיסוי לתוך בארות בודדות של צלחת שש באר המכילה שני מיליליטר של ציטראט נתרן מלוחים טריים ל הבאר במשך שתי שטיפות של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 90 מהפכות לדקה. בסוף הדגירה, לשטוף את הכיסויים לזמן קצר בשני מיליליטר של 0.2%Tween 20 ב 4X מלוחים נתרן ציטראט.
לגילוי DNA FISH תלת-צבעי תלת-צבעי, העבר את הכיסויים לתוך בארות בודדות של צלחת חדשה של 24 בארות וחסום כל כריכה לא ספציפית ב-300 מיקרוליטרים של חיץ חסימה למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-20 מהפכות לדקה. בסוף הדגירה, לטפל בדגימות עם הריכוז המתאים של אנטי digoxigenin ו / או סטרפטבידין מדולל במאגר חסימה במשך 35 דקות בתא חשוך ורטוב ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להעביר את הדגימות בארות בודדות של צלחת שש באר ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים בשני מיליליטר של 0.2% Tween 20 ו 4X מלוחים נתרן ציטראט במשך חמש דקות לכל לשטוף עם רועד ב 90 מהפכות לדקה.
לאחר הכביסה האחרונה, לצייד את הדגימות בשני מיליליטר של PBS לפני העברת coverslips לצלחת חדשה 24 באר עבור לאחר תיקון ב 300 microliters של 2% פורמלדהיד ב PBS לכל גם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים חמש פעמים לזמן קצר ב 300 microliters של PBS, ואחריו כתמים עם DAPI מדולל ב ננוגרם אחד למיליליטר ב 300 microliters של PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הכיסויים חמש פעמים נוספות PBS ולהסתן את הדגימות עם מדיום הרכבה מתאים.
לאחר מכן רכשו תמונות תלת-מימד באמצעות מערכת מיקרוסקופ. 3D רב צבעי DNA דגים מאפשר הדמיה עכשווית של לוקוסים גנומיים שונים בתוך גרעיני 3D משומרים. להכנת בדיקת דנ"א, גודל בדיקה של פחות מ-200 זוגות בסיסים מבטיח הליך מוצלח של DNA FISH צבעוני תלת-צבעי.
בדיקות דגים DNA תת אופטימלי המיוצר על ידי תרגום ניק יכול להיות מעוכל באופן חלקי או יתר. מעל בדיקות מתעכלות יגרום אות לא ספציפי עקב אובדן של ספציפיות בהכלאה ועלייה כתוצאה מכך של הרקע. עבור לימפוציטים T ראשוניים אנושיים ותאים קטנים עם גרעינים קטנים כמות נמוכה של ציטופלסמה, 12 דקות 0.1 טיפול חומצה הידרוכלורית נורמלי מומלץ לקדם נגישות גרעינית לבדיקות DNA ולשמור על השלמות הגרעינית.
עיכול פפסין ציטופלסמי אינו נחוץ כדי לקבל אות טוב של DNA FISH בתאים קטנים. עבור myoblasts ראשוני אנושי ותאים שיש להם גרעינים גדולים ציטופלסמה בשפע, עם זאת, צעד pepsinization הוא היסוד. פפסיניזציה קצרה ותת-אופטימלית של ציטוסקלטון תעכב את כניסת הגשוש לתוך הגרעינים המסתיימים בהיעדר אות DNA FISH.
עם זאת, אם התאים הם over pepsinized, הגרעינים לא יישארו שלמים לאבד את המבנה 3D שלהם. דג דנ"א רב-צבעי תלת-צבעי מוצלח יגרום לנוכחות אות בתוך הגרעינים. אני מציע לעבוד עם חומר ביולוגי טרי, לבדוק בדיקות לפני ביצוע 3D רב צבעי DNA FISH, הכנת פתרונות טריים להיות מדויק עם זמני הדגירה והטמפרטורות.
זכור כי formamide ו HCL הם חומרים מסוכנים תמיד יש להשתמש ברדס אדים כימיים עם חומרים חד פעמיים מתאימים.
