3D 다색 DNA FISH는 보존된 핵 내에서 다중 게놈 로시의 시각화를 가능하게 하여 단일 세포 수준에서 상호 상호 작용 및 국소화를 모호하게 정의할 수 있습니다. 3D 다색 DNA FISH는 핵 아키텍처에 대한 직접 조사를 허용합니다. 일반적으로 염색체 캡처 기반 기술과 함께 작동하여 단일 셀 내에서 C 데이터 유효성 검사를 위한 사용 가능한 도구입니다.
절차를 시연하는 것은 페데리카 마라스카입니다. 그녀는 내 실험실에서 포스트 독입니다. 시작 DNA 재료의 길이에 따라 섭씨 16도에서 열 믹서에 닉 번역 믹스를 배양하여 시작합니다.
인큐베이션이 끝나면 2.2%의 아가로즈 젤에서 프로브의 크기를 확인하십시오. 각 DNA FISH 실험에 대해, 프로브가 이중 증류수 150 마이크로리터, 라벨이 없는 연어 정자 DNA 20 마이크로그램, 3.5 마이크로그램의 특정 Cot-1 DNA, 100%에탄올3량, 1/10도의 섭씨 10도에서 1/10°C의 소양으로 프로브가 생산된 시작 DNA 물질에 따라 적절한 양의 프로브를 침전시합니다. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 최대 속도로 원심분리합니다.
상체를 폐기한 후 70%에탄올의 500 마이크로리터로 펠릿을 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, 100%의 포름아미드의 두 마이크로리터에 펠릿을 다시 중단하고 20%dextran 황산염에 4배 식염수 의 동일한 볼륨을 추가하기 전에 섭씨 40도에서 30 분 동안 프로브를 흔들어. 작은 핵과 낮은 양의 세포질로 작은 세포의 고정 전처리 및 투과화를 위해, 먼저 24웰 플레이트의 개별 우물에서 유리 커버립에 직접 PBS의 200 마이크로리터에서 여섯 번째 세포에 두 번 10을 추가하고 세포가 실온에서 30 분 동안 정착 할 수 있도록합니다.
인큐베이션이 끝나면 PBS를 300마이크로리터로 빠르게 교체하여 0.1%Tween 20으로 보충된 4%의 파라포름알데히드를 준비했습니다. 10분 후, 정수세포 300마이크로리터0.05%TPBS로 3회 세척하여 실온에서 세척당 5분간 세척합니다. 마지막 세척 후, 300 마이크로리터의 0.5%TPBS를 실온에서 10분 동안 300마이크로리터로 T세포를 투약한 후, RNA 칵테일의 웰당 250 마이크로리터로 세포를 치료하기 전에 37°C에서 1시간 동안 PBS에서 1:100을 희석하였다.
인큐베이션이 끝나면 PBS 300 마이크로리터에서 세포를 헹구고 PBS에 20%의 글리세롤 300마이크로리터를 4°C의 하룻밤 배양과 함께 각각 양립할 수 있습니다. 다음 날에는 15~30초 동안 드라이 아이스에 유리를 놓아 세포를 얼린 후 실온에서 샘플을 서서히 해동하고 PBS에서 20%의 글리세롤 300마이크로리터에 300마이크로리터를 30초 동안 담그십시오. 단지 입증된 대로 3회 더 동결/해동한 후 실온에서 5분간 0.5%TPBS의 300마이크로리터로 샘플을 세척한 다음 실온에서 세척당 5분간 0.05%TPBS의 300마이크로리터에 2개의 세척을 한다.
마지막 세척 후, 실온에서 12 분 동안 0.1 정상 염산의 300 마이크로 리터로 세포를 치료하고 식염수 나트륨 구연산 300 마이크로 리터에 2 개의 헹구는 다음. 그런 다음 실온에서 2배 식염수 나트륨 구연산염으로 50%의 300마이크로리터에서 하룻밤 사이에 샘플을 수정합니다. 고량의 세포질로 큰 세포의 고정, 사전 처리 및 투과화를 위해, 인간 1차 T 세포에 대해 입증된 바와 유사하게 세포를 수정, 사전 치료 및 투과화하고, 0.01 일반 염산에서 0.01%의 300 마이크로리터로 샘플을 치료하여 5분 에서 5초까지.
광학 현미경으로 세포를 관찰하고 핵이 세포질에서 자유롭지만 핵은 여전히 보이지 않고 그대로 보이는 즉시 50 밀리머 마그네슘 염화 마그네슘의 300 마이크로리터에서 2 개의 5 분 세차로 반응을 중지합니다. 3D 멀티 컬러 DNA FISH의 경우 혼성화 프로브를 섭씨 80도에서 5분 동안 분해하고 프로브를 얼음 위에 즉시 놓습니다. 프로브를 깨끗한 현미경 슬라이드에 로드하고 각 프로브 드롭에 셀의 뚜껑을 하나 배치합니다.
커버슬립 가장자리를 고무 시멘트로 밀봉합니다. 시멘트가 완전히 건조되면 섭씨 75도의 가열 블록에서 시료를 분해합니다. 4분 후, 수조에 떠있는 금속 상자에 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 샘플을 수화하십시오.
다음 아침, 고무 시멘트를 벗겨 내고 2배 식염수 나트륨 구연산나트륨에 침지된 슬라이드로 조심스럽게 커버립을 들어 올립니다. 각 커버슬립을 6웰 플레이트의 개별 우물에 놓고 분당 90회전에서 흔들림이 있는 섭씨 37도에서 5분간 2밀리리터의 신선한 식염수 구연산2밀리리터를 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 4배 식염수 나트륨에서 0.2%Tween 20의 2밀리리터로 커버립을 간략하게 헹구습니다.
3D 멀티 컬러 DNA FISH 검출의 경우, 커버립을 새로운 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮기고 300 마이크로리터의 블로킹 버퍼300마이크로리터에서 37°C, 분당 20개의 회전을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 37섭씨에서 어둡고 습한 챔버에서 35분 동안 블로킹 버퍼에서 희석된 항디곡시겐 및/또는 스트렙타비딘의 적절한 농도로 샘플을 처리한다. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 6웰 플레이트의 개별 우물로 옮기고 분당 90회전에서 흔들림으로 세척당 5분간 0.2%Tween 20 및 4배 식염수 의 2밀리리터로 샘플을 세 번 세척합니다.
마지막 세척 후, PBS의 두 밀리리터에 샘플을 평형화하기 전에 실온에서 2 분 동안 PBS에서 2 %의 포름 알데히드의 300 마이크로 리터에 포스트 고정을위한 새로운 24 웰 플레이트로 커버립을 전송합니다. 고정 된 세포를 PBS의 300 마이크로 리터에서 5 번 간략하게 세척한 다음 실온에서 5 분 동안 PBS의 300 마이크로 리터에서 밀리리터 당 1 나노 그램에서 희석 된 DAPI로 염색합니다. 커버립을 PBS에서 5회 더 세척하고 적절한 장착 매체로 시료를 장착합니다.
그런 다음 현미경 시스템으로 3D 이미지를 습득합니다. 3D 다색 DNA FISH는 보존된 3D 핵 내에서 다른 게놈 로시의 현대시각화를 가능하게 합니다. DNA 프로브 준비를 위해 200개 미만의 염기 쌍의 프로브 크기는 성공적인 3D 다색 DNA FISH 절차를 보장합니다.
닉 번역에 의해 생성된 최적이 아닌 DNA FISH 프로브는 부분적으로 또는 이상 소화될 수 있다. 과도하게 소화된 프로브는 혼성화의 특이성 상실과 결과적으로 배경의 증가로 인한 비특이적 신호가 발생합니다. 인간 1차 T 림프구와 작은 세포에 대해 작은 핵과 낮은 양의 세포질이 있는 경우, DNA 프로브에 대한 핵 접근성을 촉진하고 핵 무결성을 보존하기 위해 12분 0.1정상 염산 치료가 권장됩니다.
세포질 펩신 소화는 작은 세포에서 DNA FISH 좋은 신호를 얻기 위하여 필요하지 않습니다. 그러나, 인간 1차 근세포및 세포질이 풍부하게 되는 세포에 대해서는 펩시화 단계가 근본적이다. 짧고 최적이 아닌 세포골격 펩시화는 DNA FISH 신호가 없는 상태에서 끝나는 핵으로 프로브의 진입을 방해합니다.
그러나 세포가 펩시화되면 핵은 3D 구조를 잃지 않고 그대로 유지되지 않습니다. 성공적인 3D 다색 DNA FISH는 핵 내의 신호의 존재를 초래할 것이다. 나는 신선한 생물학적 재료와 함께 작업, 3D 다색 DNA FISH를 수행하기 전에 프로브를 테스트, 신선한 솔루션을 준비하고 잠복 시간과 온도에 정확하다.
포르마이드와 HCL은 유해 물질이며 항상 적절한 일회용 물질이있는 화학 연기 후드에 사용되어야한다는 것을 기억하십시오.
