当社のプロトコルは、FFPE由来のRNAサンプルから生成される遺伝子発現データの質と量を改善するために使用することができます, 特に最適でない品質サンプルで.この技術は、FFPE組織サンプル内のRNA品質を評価し、下流処理の最適化を可能にし、サンプルシーケンシングデータの量と品質を向上させます。この方法は、生物学的および臨床サンプルにおける転写産物の包括的な特徴付けを可能にし、開発および疾患におけるゲノムの機能的要素に関する洞察を提供し得る。
サンプルQC、ライブラリ調製、およびデータ分析のための方法のFFPE-RNA分解および選択はすべて非常に難しい場合があります。適切なメソッドと適切なコントロールを選択する際には、細心の注意を払います。視覚的なデモンストレーションにより、特に保存状態の悪い FFPE サンプルの計画、評価、およびシーケンシング プロセス中に必要なわずかな変更と予防措置を観察できます。
RNAサンプルの品質を確認するには、メーカーの指示に従ってRNA QCシステム上でサンプルを実行し、適切なバイオアナリシスソフトウェアを使用してサンプル内のRNA断片の分布を分析し、100ヌクレオチドと200ヌクレオチドより長い断片の割合を計算します。QCメトリックに基づいて、100ヌクレオチドより長いフラグメントの40%未満のサンプルを特定し、これらのサンプルを処理から除外できるようにします。シーケンシングの場合は、室温の水浴で実行パラメータに従って適切なシーケンシング試薬キットを解凍し、解凍後に試薬トレイを摂氏4度に置きます。
フローセルパッケージを室温で30分間置きます。パッケージが温まるときに、Illumina 実験マネージャー アプリケーションを開き、[サンプル シートの作成] を選択します。使用するシーケンサを選択し、[次へ]をクリックします。
試薬キットのバーコードと、その他の適切なワークフローパラメータを入力します。次に、イルミナシーケンス基準に従って作成したサンプルシートをアップロードします。サンプルライブラリとコントロールライブラリPhiXを調製するには、適切な濃度にライブラリを変性および希釈し、サンプルとPhiXコントロールライブラリを混合して5%PhiX制御体積比を得る。
フローセルの準備ができたら、ラッピングを取り除き、糸くずのないアルコール拭き取りでガラス表面をきれいにし、低い糸くず実験室組織でガラスを乾燥させます。試薬カートリッジを4°Cのストレージから取り外し、カートリッジを5回反転させて試薬を混ぜます。ベンチのカートリッジを軽くタップして気泡を減らし、変性した希釈したサンプルを指定されたリザーバーの試薬カートリッジに積み込みます。
フローセル、バッファーカートリッジ、試薬カートリッジをシステムにロードします。次に、自動チェックを実行し、出力を確認して、実行パラメーターがシステムチェックに合格していることを確認します。自動チェックが完了したら、[開始] を選択してシーケンス実行を開始します。
前処理 QC および後アライメント QC の結果を視覚化するには、マルチ QC を実行して HTML 形式の集計レポートを生成します。バッチ効果を決定し、指定されたデータセットの品質マップを評価するには、R スクリプトを使用して主成分分析を実行します。サンプル相関分析は、次いで、異なるサンプル間のピアソン相関を使用して行うことができる。
100ヌクレオチドより長い断片の割合の推定は、高分解RNAサンプルの小さな断片サイズの割合を正確に測定する場合に感度が高いため、200ヌクレオチドよりも長い断片の推定よりも有用です。サンプルセットの分解度が高いことを考えると、トータルRNAライブラリ調製方法が推奨されます。例えば、4つの異なるサンプルから作成されたシーケンスライブラリをここに示します。
ここでは、Raw FastQ ファイルのシーケンス品質とサンプル アダプタの内容の概要を示します。FastQC スクリーニングは、サンプル内の細菌やマウスの汚染などの汚染を検出するのに役立ちます。STARアライメントを使用して、参照ゲノムにマッピングされた読み取りの割合、参照ゲノムに一意にマッピングされた読み取りの割合、マッピングされなかった読み取りの割合、または複数の遺伝子座にマッピングされた読み取りの割合を決定できます。
カードおよびRSeQC統計は、マップされた読み取りに存在するメッセンジャーRNA、イントロニックおよびインタージェニックな塩基の割合を決定するために使用することができる。これらの代表的な分析では、一部の劣化したライブラリには、5つのプライムエンドよりも多くの読み取りが3つの素数に近いマッピングされる3つの主要なバイアスがありました。さらに、主成分分析を行い、各サンプルの生物学的複製に対して主成分によって捕捉された総ばらの割合を求めることができる。
サンプルの劣化を避け、各サンプルに反復と複数のコートを準備し、適切なメトリックを使用してサンプルの品質を評価し、適切なライブラリ調製方法を使用してください。この方法論を用いて、より大きなNGS研究は、様々な保存時間と条件を持つ以前は使用できなかったFFPEサンプルで行われ、さまざまな疾患状態に関する洞察を得ることができます。この技術は、研究者が豊富な臨床情報を持つFFPEサンプルの既存の大規模なアーカイブを研究する道を開き、人口ベースの癌研究を大幅に強化することができます。
