我々 は腫瘍グループ AAML1531 子どもと看護師の保健研究患者サンプルの形で彼らの貢献のために参加者に感謝します。この仕事、国立衛生研究所 (UM1 CA186107、RO1 CA49449 RO1 CA149445)、子供の発見研究所のワシントン大学とセントルイス子供病院 (MC-II-2015-461) とイーライ セス ・ マシューズ白血病財団によって資金を供給されました。

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著者が明らかに何もありません。

ここでは、さまざまな病気で低 VAFs と突然変異を研究する簡単に実装することができますシーケンスのエラー修正プロトコルのスイートを紹介します。最も重要な彼らは raw 読み取りのエラー訂正を有効にすると各分子シーケンスの前に行政の混入であります。ここで説明する方法は、市販遺伝子パネルおよび自己設計されていた遺伝子特定 oligos の両方にカスタマイズされた行政を組み込む研究者を許可します。
NGS の標準プロトコル シーケンス エラー率 2% 以下エンと遺伝子変異の検出を排除する、これは稀な変形の検出は重要な研究の NGS のアプリケーションを制限します。標準の NGS 誤り率を回避、ECS これら生の変異体の高感度検出できます。例えば、これらの突然変異は最初 (したがって、低エン) 起こるとき病原性の変異の検出は病気14,15の早期介入を通知することが不可欠。白血病研究、最小残差の検出の病 (治療後残存白血病細胞) がリスク層別化を通知し、バイナリ流れフローサイトメトリー評価できない方法で治療の選択肢が通知される可能性があります。さらに、ECS は循環腫瘍核酸を検出し、プライマリの特性は、特定の突然変異のバリアントの負担と同様に有無を評価することによって固形腫瘍患者における転移能を評価する適切です腫瘍16。
表 1に示されているように、バリアントを呼び出す位置固有のエラーの二項分布に基づくモデルを使用しての力はエラー モデルの構築に使用されるシーケンスの深さと同様に、シーケンスされたライブラリの数に大きく依存します。エラー モデルのロバスト性のサンプルと詳細シーケンス数の増加とともに増加します。各サンプルのエラー プロファイルを構築するサンプルあたり 3000 x のエラー修正リード カバレッジの平均で少なくとも 10 シーケンスされたサンプルを使用することをお勧めします。位置特定方法と同じです、MAGERI がすべての六つの異なる置換タイプの集計エラー率を使用しての代わり (A > C/T > G、A > G/T > C、A > T/T >、C > A/G > T、C > G > C、C > T/G > A)13, 我々 はすべての位置で独立して各置換モデルします。例えば、C のエラー発生率 > 所定ゲノムの位置に T は別の位置から異なる。我々 のアプローチも考慮シーケンス バッチ効果シーケンス実行の 1 つにみられる塩基置換率は別の実行から異なる場合があります。したがって異なるシーケンスの実行からのサンプルはモデルの構築にプールされる場合は特にすべての置換型のそれぞれの位置をモデル化することが重要です。
ECS 実験を設計するときの重要な考慮事項は、所望の検出のしきい値です。NGS 研究の美しさは遺伝子/ターゲットの興味、(配列の深さによって決定)、検出しきい値および照会個体数の面で、簡単に縮小できます。たとえば、研究者が 0.0001 の検出閾値を持つ 2 つの産物のまれな突然変異を見つけるに興味があるなら、MiSeq V2 化学まで 1500 万読み取りを出力を使用して実行、単一シーケンスで最大限に 75 検体をプールできる (2 amplicons * 10,000分子 * 10 読み取りエラー補正 * 75 検体 = 1500 万配列読み取り)。研究者は分子シーケンスまたは検出しきい値を調整するために実行する単一シーケンスでプールされたサンプルの数に入るの数を変更できます。私たちの研究で検出しきい値を持つ 0.0001 エン (1:10, 000) の突然変異を見つけることを目指しましたイルミナ遺伝子パネルを使用します。我々 は日常的に 250 を使用して十分な分子が前述の検出閾値を達成するためにキャプチャされるように DNA の開始の ng。研究者は、DNA の低量の開始する選ぶことができます (50 ng をお勧めします) 目的の検出限界がある場合 > 0.001 エン。
行政は、i5 のインデックスに追加されます、シーケンス設定はそれに応じて改正されるあります。たとえば、16 の N 行政を使いました、シーケンス設定された 2 x 144 対最後の読み取り、インデックス 1 の 8 サイクル、インデックス 2 の通常 8 サイクルではなくインデックス 2 の 16 のサイクル。インデックス 2 サイクルの増加は、読み取りに割り当てられた合計回数の減少によって補償されています。研究者は 12 n Umi10,17を使用することを選ぶ、設定はインデックス 2 の 12 のサイクルを変更する必要があります。
この海ベースのシーケンスのメソッドは、シーケンス エラーの修正に最適です。すべて増幅方式のための問題である PCR 表示をあつかう上で最適ではないままです。ポスト シーケンスと ddPCR を使用してポスト バイオインフォマティクス検証のラウンドを行い、我々 はほとんど PCR 表示による任意の偽陽性を検出します。それにもかかわらず、研究者が低増幅エラー高忠実度ポリメラーゼを用いた実験を行うことをお勧めします。

我々 として年齢、変異原性物質と細胞分裂結果、ゲノム、これで身体異常の蓄積で中確率のエラーへの暴露の基となる悪性転化の根本的な病因神経疾患、小児障害と正常な老化1,2。病気運転可能性と体細胞突然変異は、早期発見とリスク管理3,4、5の重要な診断と予後バイオ マーカーです。生理学的な clonogenesis が理解するために臨床通知し、意思決定、定量の正確さおよびこれらの突然変異の特性を研究する重要です。次世代シーケンス (NGS) は、異種の DNA サンプルにクローン変異の研究に現在使用されてただし、NGS は突然変異を識別する制限 > 0.02 バリアント アレル分数 (エン)-0.5-2.0 の固有の誤り率のためシーケンス プラットフォーム6,7,8%。その結果、診断と予後追跡低いエンで重要な体の亜種では得られない標準 NGS。
近年、様々 なメソッドは、NGS8,9,10,11のエラー率を回避するために開発されています。これらのメソッドは、シーケンス処理の後のエラー訂正を可能分子タギングを利用します。各分子やゲノム断片配列ライブラリでは付くと、ランダムなユニークな分子識別子 (UMI) その分子に固有です。行政は、無作為化ヌクレオチド (8-16 N) の文字列の順列を構築されています。2 番目サンプル固有のバーコードも、ワークフロー実行同じ NGS シーケンスに複数のサンプルを多重伝送が可能に統合されます。Pcr は分子タグ ライブラリで実行され、シーケンス処理用ライブラリを送信するその後。ライブラリの準備中、エラーでがゲノム フラグメントを pcr とシーケンス8中にランダムに導入されることが期待されます。ランダムなシーケンス エラーを削除するには、生配列読み取りが UMI に従ってグループ化されます。シーケンスからの人工物は真のバリアントが忠実に増幅し、同じ海を共有すべての読み取りでシーケンスに対し導入の確率論的性質同じゲノムの位置に同じ海ですべての読み取りに存在することは行われません。成果物が削除されます bioinformatically です。ここでは、3 つのメソッドのエラー修正のシーケンス (ECS) 研究所単一のヌクレオチドの亜種 (SNVs) と小さな挿入削除 (オクターリピート) を識別するために DNA および RNA 遺伝子発現下の定量化を容易にするための最適化について述べる、NGS のエラーのしきい値。
最初の方法では、研究者によって設計された遺伝子特異的プライマーを用いた珍しい体イベントを探す方法について説明します。ライブラリの準備の前に研究者は興味のかけらをターゲットにプライマーを設計する必要があります。Web アプリ Primer3 を使いました (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。200-250 bp の産物は、これらは、行政が組み込まれて一度ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に最適、ペアエンド リード 150 bp ペアエンド リードでの重複を生成します。使用する最適なプライマー設計条件: 最小プライマー サイズ = 19;最適なプライマー サイズ = 25;最大プライマー サイズ = 30;最小 Tm = 64 ° C;最適な Tm = 70 ° C;最大 Tm = 74 ° C;Tm 差の最大値 = 5 ° C;GC の最小の内容 = 45;最大 GC コンテンツ = 80。返される数 = 20;最大 3' 端安定性 = 100。
方法 2 のクローン SNVs と小さなオクターリピート 0.0001 エン amplicons の数百を含む市販遺伝子パネルを使用してのようにまれにイルミナ化学と ECS DNA のプロトコルを組み合わせる手法について述べる.TruSight 骨髄性シーケンス パネル (イルミナ) を実験に使用し、小児の骨髄性疾患のための興味の遺伝子を含むように拡張されたパネルを設計しました。これらのパネルがこれらのパネルに独自のアダプターの戦略を追加しましたので、エラー訂正を促進するようなユニークな分子識別子 (Umi) を提供していません。ECS が動作するはずです同様に他のさまざまな病気と関連付けられる遺伝子の豊かに設計のパネルのいずれかで。次の DNA の隔離および組織または目的の標本から後続の定量化、それは少なくとも 500 に勧め株 DNA 試料当りの ng。我々 は日常的に 250 を使用して単一配列ライブラリを作る ng の下流をできるだけ多くユニークなゲノム フラグメントとしてキャプチャするために DNA の重複とエン計算を読み取ります。残りの 250 とオプションの複製シーケンス ライブラリを作ることができる DNA の ng。標本あたり 2 つのライブラリのレプリケートを常に確認、真陽性として両方の複製で独立して検出されたイベントのみを考えます。4,13を呼び出すバリエーションの精度を高めるためのゲノム位置特異的二項エラー モデルを実施します。
最後に、ECS を市販の QIAseq ターゲット RNA パネル (Qiagen) を使用して転写定量化のための RNA シーケンスに結合手法について述べる。重複除外に必要な行政とエラー訂正は、キットに盛り込まれているし、研究者は、ライブラリの製造元の推奨事項に従います。Bioinformatically、研究者は、ECS-DNA のプロトコル セクションで詳細に説明するために概説パイプラインを従うことができます。

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adapter sequences</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

従来の次世代シーケンシング技術 (NGS) は、10 年以上の巨大なゲノム解析を許可しています。具体的には、NGS は悪性腫瘍にクローン変異のスペクトルを分析するために使用されています。従来サンガー、NGS 闘争その高い誤り率 ~0.5–2.0% によるまれなクローンと subclonal 突然変異を識別するよりもはるかに効率的です。したがってがある突然変異の検出限界を持つ標準的な NGS > 0.02 バリアント アレル分数 (エン)。患者のまれな突然変異の臨床的意義、知られている病気は、明白でなく残ることがなく白血病の治療を受けた患者が大幅に向上成果残存病変が < フローサイトメトリーによる 0.0001。NGS のこの artefactual 背景を軽減するために多くの方法が開発されています。ここでエラー修正 DNA および RNA シーケンス (ECS)、エラー訂正のため 16 bp ランダム インデックスと多重化のための 8 bp 患者固有のインデックスの個々 の分子のタグ付けを含むため手法について述べる。本手法は検出し、バリアント アレル分数 (VAFs) 2 桁の NGS の検出限界よりも低く、0.0001 エンのようにまれにクローン変異を追跡できます。

Targeted Error-Corrected は、DNA の配列に突然変異患者商業の genomic DNA の DNA を希釈原理検証実験の証拠を行った。患者は、GATA1 突然変異 (chrX:48650264、C > G) 0.19 の元エンと。図 1に ECS が単一のヌクレオチドのバリアントのため 1: 10,000 レベルを定量的であることを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> 図 1: GATA1 SNV が ECS が 1: 10,000 レベルを定量的であることを示す希釈系列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
また、ECS DNA は確実に高齢健常者4成人急性骨髄性白血病 (AML) における反復的遺伝子のまれなクローン変異を検出.バンク約離れて 〜 10 年ナースの健康における 20 健常者からバフィー コートのサンプルを入手しました。我々 はこれらのサンプルに ECS DNA パネル プロトコルを適用されます。この実験は、我々 イルミナ TruSight 骨髄性シーケンス パネル 568 amplicons (詳細 https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html の遺伝子リスト) で構成される適応し、シーケンス20 人から 80 ライブラリ (異なる時点での 2 コレクションは、時間ごとに個別あたり 2 複製ポイント) 4770 万ペアエンド読み取りの平均と 340 万エラー修正の平均を生成するイルミナ NextSeq プラットフォームを使用してライブラリ4ごとコンセンサス配列。ライブラリあたり平均ヌクレオチド報道約 6,000 (3.4 百万 568 で割った値) x だった。各サンプルでは、同じサンプルからはシーケンスのライブラリを使用して位置固有のエラー プロファイルを構築しました。我々 は、少なくとも 1 つのコレクションの時間ポイントの両方のレプリケートに存在していた 109 のクローン体細胞の突然変異を見つけた。これらの突然変異があるエン 0.0003-0.1451 に至る。既知の宇宙の表現と 21 の突然変異を選択し、ddPCR を使用して 1 つまたは 2 つのコレクションの時間ポイントのすべての 21 の変異を検証 (n = 34、図 2、若いら20164から適応)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> 図 2: ECS によって識別される突然変異が高い一致 VAFs と ddPCR を介して確認した。(n = 34、若いら20164から変更)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
(QIAseq 人間癌トランスクリプトーム パネルから適応)、種々 の癌と関連付けられる知られていた 416 の遺伝子で構成される QIAseq 化学を用いた遺伝子パネルをカスタマイズしました ECS RNA のプロトコルを使用して表現のエラー訂正レベルに関してある特定の遺伝子 (遺伝子リスト補足資料1) の最も一般に表されたエクソンを増幅します。我々 はライブラリあたり 830 万読み取りの平均を与えたペアエンド形式でイルミナ MiSeq プラットフォームを使用してライブラリを塩基配列し、41 万 7000 エラー修正コンセンサス シーケンスの平均値を取り込むことができた。低豊富な転写産物の発現レベルを示した (< 1,000 トラン スクリプト数 50 ng のトータル RNA の) 複製間再現性の高い、(データ ポイント n = 300、図 3)。DdPCR (表現の度合いの六つの選択した遺伝子) を使用した検証は、遺伝子の発現レベルが正しく正規化を必要とせず ECS プロトコルによって捕獲されていたことを示した。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> 図 3: 同じサンプルの複製の間 ECS RNA によって上部には、トラン スクリプトの相関をカウント (n = 300).下、ECS で識別されるカウントは ddPCR によって立証されたトラン スクリプト (n = 6)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

12.0K ビュー.  Washington University School of Medicine. 次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。

ビデオ: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

遺伝学

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

がん研究

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

<meta charset="utf8"></head><body>DNA中の希少点変異の肉眼検出

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

DNA中の希少点変異の肉眼検出

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

生化学

<meta charset="utf8"></head><body>野生型ブロッキングPCRによる低頻度変異検出の最適化

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:がん組織における低周波変異の検出の促進

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

要約

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低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

DNA中の希少点変異の肉眼検出

DNA中の希少点変異の肉眼検出

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR