私たちがここに提示するプロトコルは、胚の無数性をスクリーニングするための迅速かつ低コストのセミコンダクター、シーケンシングベースの方法です。テンプレートの増幅を行うための洗練されたプロトコルとシーケンシングライブラリの配置により、PGTA検出は再現性、高スループット、コスト効率と時間の節約になります。この半導体シーケンサーの実行時間はわずか2〜4時間です。
サンプルの受信からレポートの発行までの所要時間を 5 日間短縮します。この方法は、異数化スクリーニング、コピー数変動、および一塩基多型呼び出しのためのゲノムシーケンシングを提供する。異なるシーケンシング化学のために、このプロトコルによって準備されたライブラリは、他のシーケンスシステム上で直接配列することはできません。
しかし、同じシーケンサーは、異なるライブラリ調製物であるが、非侵襲的な出生前スクリーニングを行うことができる。この手順のデモンストレーションは、当研究室の技術者であるシャンチュン・グオです。シーケンシングを開始するには、各希釈されたライブラリを渦巻き、毎回3秒間ミニ遠心分離機で4回短時間回転します。
次いで、各ライブラリーの5マイクロリットルを取り、核を含まない、5ミリリットルチューブを1点にプールする。混合ライブラリを渦巻き、3秒間ミニ遠心分離機で短時間回転します。2つの新しい回収管に、壊れた溶液の150マイクロリットルを加えます。
新しい回復管、回復用ルータおよび増幅版を取付けなさい。オイルボトルを3回反転して混ぜます。オイルと回収液の両方が少なくとも3分の2満杯であることを確認してください。
30秒間、マスターミックスPCRバッファーをボルテックスし、3秒間ミニ遠心分離機で短時間スピンします。球体粒子と混合ライブラリを1分間渦巻きし、ミニ遠心分離機で3秒間短時間回転します。次に、2400マイクロリットルのライゲーションミックスを調製し、172マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、8マイクロリットルの混合ライブラリー、120マイクロリットルの酵素ミックス、および100マイクロリットルの球体粒子を、マスターミックスPCRバッファーの2000マイクロリットルを含むチューブに加える。
ピペットを800マイクロリットルにセットし、サンプルポートを通して反応フィルターにライゲーションミックスをロードします。オイルボトルを3回反転し、P1000ピペットを使用して反応フィルターに200マイクロリットルの反応油を加えます。プログラム Proton を選択し、モニターの指示に従ってデバイスが正しくセットアップされていることを確認するために、補助ボタンを選択します。
次へをクリックしてプログラムを起動します。エマルジョンPCR製品サンプルの100マイクロリットル、洗浄ビーズの130マイクロリットル、ES洗浄液の300マイクロリットル、および300マイクロリットルの溶融溶液を8つのチューブストリップにロードします。8本のチューブストリップを濃縮システムに配置します。
ピペットチップと新しいゼロポイント2ミリリットルチューブをインストールし、プログラムを開始します。遠心分離器は、ゼロ点2ミリリットルチューブを15で、500倍Gで5分間行う。上清を捨て、濃縮製品の10マイクロリットルを保管してください。
200マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をチューブに加え、渦を混ぜて混ぜます。再びゼロ点2ミリリットルチューブを遠心分離する。上清を捨て、濃縮製品の10マイクロリットルを保管してください。
ヌクレアーゼフリー水90マイクロリットルをチューブに加え、渦を混ぜて混ぜます。テンプレートを準備するには、ポジティブコントロールを渦を出して、短時間スピンします。濃縮製品の100マイクロリットルに正のコントロールの5マイクロリットルを追加します。
ボルテックスと遠心分離機を15,500倍Gで5分間行う。上清を捨てて、テンプレートの10マイクロリットルを保管してください。次に、シーケンシングプライマーの20マイクロリットル、および15マイクロリットルのアニーリングバッファーをテンプレートチューブに加えます。
チューブを渦巻きし、3秒間ミニ遠心分離機で短時間回転します。加熱された蓋を用いて、チューブをサーマルサイクラーにインキュベートします。次に、10マイクロリットルの荷重バッファーをチューブに加えます。
上下にピペットを入れ、混ぜます。55マイクロリットルのサンプルを上下にピペットで混ぜ、サンプルをチップのローディングウェルにロードします。使用するピペットチップとゼロポイント2ミリリットルPCRチューブを保管してください。
チップにサンプルが入ったら、チップをチップミニ遠心分離機に置きます。位置を確認し、チップを10分間遠心します。500マイクロリットルのアニーリングバッファーと500マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を1点5ミリリットルチューブに加えて50%アニールバッファーを調製します。
洗浄液を調製し、500マイクロリットルのアニーリングバッファーと500マイクロリットルの100%2-プロパノールを1点5ミリリットルチューブに加えます。次いで、発泡混合物を調製し、50%焼鈍緩衝液の49マイクロリットル及び発泡液の1マイクロリットルを2つの新しい1点5ミリリットルチューブに加えた。ピペット空気を発泡混合物の1つに、そして120マイクロリットルの気泡を装填井戸に積み込む。
過度に排出された液体を出口からローディングウェルに移し、チップミニ遠心分離機でチップを30秒間遠心します。2 番目の発泡混合物のプロセスを繰り返します。50%アニールバッファーの 55 マイクロリットルをゼロポイント 2 ミリリットルチューブに加えます。
ピペットチップを使用して、ピペットを上下にします。アニーリングバッファーの 55 マイクロリットルをすべてロードウェルにロードします。指定されたチップミニ遠心分離機でチップを30秒間遠心分離します。
100マイクロリットルのフラッシュ溶液をチップローディングウェルにロードし、排出された液体を出口井戸から捨てます。このロード手順を 1 回繰り返します。50%アニールバッファの100マイクロリットルをチップローディングウェルに積み込みます。
このロード手順を合計 3 回繰り返します。50%アニールバッファーの 60 マイクロリットルとシーケンシング酵素の 6 マイクロリットルを新しい 1 ポイント 5 ミリリットルチューブに加えます。上下にピペットを入れ、混ぜます。
この混合溶液の65マイクロリットルをチップローディングウェルにゆっくりとピペットし、気泡を避けます。チップを光から遠ざけ、室温で5分間インキュベートします。最後に、インキュベーションの後、すぐにシーケンサーにチップをロードし、シーケンス実行を開始をクリックしてシーケンスを開始します。
186の切断段階および1135個の胚盤胞期胚に関する遡及的統計分析は、両方のタイプのサンプルにおいて95%以上のWGA成功率をもたらした。シーケンシング品質管理の失敗率は、切断段階群で3.4%、胚盤胞期群ではわずか1.9%であった。非効率法の他に、シーケンスデータを他の分析に使用できます。
たとえば、サイズが 5 メガベース未満の数値のバリエーションや、シーケンスの深さと品質に応じて mycondrial DNA 分析をコピーします。コピー数の呼び出しの改善により、研究者はヒト初期胚における染色体モザイク化の将来をさらに調査することができます。
