酵母は、遺伝学的研究のためだけでなく、野生型および変異酵母株から抽出されたタンパク質および他の高分子の生化学的研究のためにも人気のあるモデル生物である。しかし、その細胞壁の厳しいため、研究者が直面する大きな課題は、細胞の含有量を損なうことなく酵母細胞のこの効率的なリシスです。無傷の生体高分子の単離は、通常、温度に依存して重要である。
低温で抽出物を調製することで、細胞内プロテアーゼとヌクレアーゼが不活性のままであり、無傷のタンパク質、核酸、および十分な陰合しとなる他の高分子の確実な単離が得られます。酵素、化学的、物理的なリシスを介して酵母エキスを得るために様々な方法が利用可能です。しかし酵素的なリシスは、細胞壁を消化するために精製酵素の要件のために高価であり、したがって、より少ない数の細胞の使用を制限する。
さらに酵素反応は、細胞の過剰消化および早期の分解を防ぐために注意深く監視されなければならない。強力な変性剤を用いた化学的方法は、効果的であるが、タンパク質の変性をもたらすため、タンパク質複合体または機能性酵素の単離には適さない。フランスのプレスで高圧下でのライシスなどの物理的な方法は、4摂氏で寒さの中で行うことができますが、それはすべてのネイティブタンパク質の劣化や変性を防ぐのに十分な寒さではありません。
他の一般的な物理的方法は、溶石および害虫、ブレンダー、またはコーヒーグラインダーを使用して、溶石または粉砕として凍結した酵母細胞を粉砕し、速い準備ビーズビーターミルまたは超音波処理による溶菌でガラスビーズと酵母の混合物として凍結する。しかし、手動粉砕は労力を要し、得られるタンパク質収量は、ブレンダー、コーヒーグラインダー、またはビーズビーターミルでの超音波処理または粉砕によって溶石を用いる技術によってかなり異なる可能性があり、タンパク質の変性および分解をもたらす。そのため、機能性タンパク質複合体の精製、生化学的アッセイ、または翻訳後修飾の検出などの用途に対して、タンパク質を生来の状態でタンパク質と共に分解する酵母細胞のライシスを最小限に抑えるには、細胞の量にかかわらず効率的なリシスを可能にしながら、容易にスケーラブルな分解法を用いることが不可欠です。
ここでは、液体窒素中の細胞のリシスに対して、マイナス196°Cの凍結冷凍工場を使用して凍結細胞抽出物を生成し、タンパク質やDNA、RNAなどの無傷の機能性高分子を、変性や分解を最小限に抑える非常に低い温度で回収できるようにする方法を説明する。この方法は、考古学的部位から回収された、または永久凍土で凍結された法医学および古代のサンプルを含む、あらゆる種の細胞または組織サンプルの任意のタイプで使用するために容易に適応することができる。冷凍工場は、ステンレス鋼のエンドプラグ間で粉砕されるサンプルを含むポリカーボネートファイル内で固体金属バーを迅速に前後に移動させる超伝導電磁粉砕室を使用しています。
この物理的な細胞のライシス法は、より効率的なリシスを可能にし、再現的により、より良い品質の抽出物を生み出す。酵母細胞は1ミルあたり1000万個の濃度で増殖した。これらの酵母細胞は、冷やした遠心分離機瓶をあらかじめ置き、2,400Gで10分間紡球した。
このペレットを少量の氷冷水中に再懸濁し、培養液の初期体積の約半分を細胞を洗浄した。再懸濁された細胞は、2、400 Gでさらに10分間再びスピンダウンされた後、次のスピンが完了すると、ペレットを乱すことなくすべての上清をデカントします。このペレットは再懸濁され、15 MLの氷冷ライシスバッファーになります。
ペレットが完全に再懸濁されていることを確認します。再懸濁された細胞は、次のステップの準備ができるまで、事前にマークされたチューブの氷の上に残る必要があります。安全メガネ、手の保護、ラボコートなどの液体窒素を取り扱う場合は、必ず個人用保護具を着用してください。
私たちの器用さを最大限にするために、私たちはしばしば2組のニトリル手袋の間に挟まれた白い熱手袋を着用します。液体窒素にさらされた後に裂けやすいため、アウター手袋とニトリル手袋を頻繁に交換してください。私たちの研究室では、液体窒素のアリコートを小さな5リットルの液体窒素容器に移します。
液体窒素は、ドライアイスにあらかじめ冷やされた50 MLチューブに注がれる。50 MLチューブが液体窒素でいっぱいになると、酵母エキスを1.5ミリリットル単位でチューブにドロップワイズでゆっくりと加えます。大きなポップコーンペレットの形成を最小限に抑えるために、酵母懸濁液を円形運動で加える。
さらに大きなポップコーンペレットの形成を防ぐために、我々はすべてのペレットが直径0.3〜0.5センチメートルの間にあることを確認するために大きな鉗子を使用しています。液体窒素は常に蒸発しているので、酵母懸濁液の各1.5ミルアリコを加える前に、液体窒素でチューブを補充してください。すべての酵母懸濁液がポップコーンに作られたら、ポップコーン付きのチューブを蓋なしで2〜3分間座らせて、残りの液体窒素のすべてを蒸発させます。
液体窒素がすべて蒸発したことを確認するには、蓋をほぼ完全に閉じて穏やかに振ります。ヒスノイズがある場合、液体窒素がまだ完全に蒸発していないことを示します。蓋を1分ほど開けて、残りの液体窒素が蒸発してから蓋をしっかりと閉じます。
蓋が途中で閉じた場合、チューブ内の残留液が爆発を引き起こす可能性があります。この酵母ポップコーンは、マイナス80度C.少なくとも5つのサンプルのために、利用可能な液体窒素の30〜35リットルを持っていることを確認し、ほぼ無期限に保存することができます。冷凍工場をフルラインに充填し、蓋を閉めて冷凍工場を数分間冷まします。
繰り返しますが、液体窒素を扱うときは、常に個人的な保護具を着用することを忘れないでください。ポリカーボネート研削バイアル、ステンレス鋼の端栓、およびインビターバーは液体窒素であらかじめ冷やされなければなりません。液体窒素が泡立ち止まるまで、これらの成分を水没させておいてください。
全体の粉砕プロセスが完了するまで、ドライアイスにすべてのポップコーンサンプルを維持することを忘れないでください。粉砕バイアルからすべての液体窒素を引き出し、あなたのポップコーンをバイアルに移します。マグネットインフォータバーも粉砕バイアルに入れるのを忘れないでください。
ステンレスプラグを粉砕バイアルの端に均等に置いて、粉砕バイアルをシールします。私たちは、振動吸収ゴムの裏地を備えた木製のブレッドボード上の研削バイアルの両端を強打し、端のプラグが正しく配置され、研削バイアルをしっかりと密封しています。エンドプラグを固定して、緩んでしまい、粉砕工程中にサンプルが冷凍工場にこぼれないようにすることが重要です。
冷凍庫の粉砕室に粉砕バイアルを置き、所定の位置にロックします。冷凍工場の蓋を閉じ、1サイクルあたり2分で3サイクル、破砕速度14でサンプルを粉砕します。粉砕サイクルが完了した後、凍結粉末細胞のライセートでバイアルのロックを解除します。
ライセートが解凍されないようにするには、開口部ツールを使用して端部プラグの1つを素早く慎重に取り外します。バイアルが開いたら、インビターバーを取り外し、冷凍粉末エキスを冷やしたプラスチック製の計量皿に素早く移します。木製のブレッドボード上のバイアルを叩いて、できるだけ冷凍エキスを回収します。
すべての粉末がバイアルから取り出されたら、すべての粉末抽出物をドライアイスに保管しておくあらかじめラベル付けされた15milチューブに素早く移します。解凍を進め、タンパク質の分解を最小限に抑えるためにすぐに抽出物を使用するのが最善ですが、冷凍粉末のライセートは必要に応じてマイナス80で一晩保存することができます。アイスバケツの中の磁気攪拌棒を使用して継続的に循環する氷のスラリーでゆっくりと粉末溶石を解凍します。
解凍を容易にするために、チューブの外側に頻繁に発生する氷を、約5分おきに除去します。抽出物が1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと10マイクロモルプロテアソーム阻害剤MG132で解凍し始めると、タンパク質の分解を防ぎます。サンプルが完全に解凍されると、1時間以上かかる可能性があり、3,220 Gのサンプルを4°Cで20分間回転させます。
このスピンは、細胞の破片のほとんどを、リセートから取り除きます。スピンが完了すると、上清を氷上であらかじめ冷やしたポリカーボネートボトルに移し、ペレットを捨てます。遠心分離物は、抽出物を明確にするために、摂氏4度で16,000Gのサンプルと16,000Gで20分間遠心する。
スピンが完了した後、上にピースを含む曇りの層や遠心管の底部のペレット状の破片を邪魔することなく、液体カラムの中央から慎重に透明な上清のみを回収します。透明なライセートを新鮮な冷やされた15ミルチューブに移します。残りの曇った液体は、卸売地のリセートのいくつかのより多くの回復を可能にするために、同じ速度で5分間最新化することができます。
この抽出物は、タンパク質複合体の精製や免疫沈降などの実験に使用する準備が整いました。酵母細胞のリシスの2つの異なる方法、すなわち4摂氏のガラスビーズ粉砕とマイナス196°Cの自動クライオ粉砕法を比較して、両方の方法で調製された相対的な回収タンパク質および細胞抽出物を評価しました。この研究から、タンデムHIS-MYCタグ付きユビキチンを発現する高コピープラスミドを運ぶ出芽酵母株を使用することを選択しました。
したがって、TALONコバルトHISタグアフィニティビーズを使用したアフィニティ精製後、モノクローナルHISタグ抗体によるウェスタンブロッティングを使用して、卸売抽出物からのタグ付きポリユビキチン化タンパク質の回収の親和性を評価することができます。ユビキチンプロテアソーム機械による急速な分解のために通常非常に短命であるポリユビキチン化タンパク質は、異なる方法で調製された卸売抽出物の品質を比較する非常に良い方法を提供します。ポンソー染色膜の右半分からわかるように、卸売抽出レーン全体でより集中的なポンソー染色によって判断されるように、クライオ冷凍工場プロトコルによって調製された卸売抽出物のより高い総タンパク質収量を回収しました。
これは、フリーザーミル全体の車線を抽出する下側と上部部分で特に明確です。さらに、HISタグの右半分のウェスタンブロットが示すように、我々は、低温粉砕によって調製された卸売抽出物からタロンビーズを使用して引き下げ続けて、HIS-MYCタグユビキチン化タンパク質のより良い回復を観察した。我々は、極低温冷凍工場は、特に下流の適用に機能的な高分子が必要な場合に、細胞抽出物の調製のための他の方法よりも優れていると結論付ける。
