This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

注意：それらを使用する前に、種々の試薬の物質安全データシート（MSDSの）を参照してください。試料調製の際に使用される化学物質のいくつかは、毒性発がん性、変異原性、および/または生殖毒性です。サンプルの処理中にヒュームフードの下で個人用保護具（手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）とワークを使用してください。ウルトラミクロトームで試料を区画することは鋭利な器具の使用を含む、およびこれらのツールを慎重に使用することは必須です。以下に説明する手順では、著者らは、試料は、細胞培養サンプルであると仮定する。プロトコルは、サンプルの種類、特に遠心分離工程に応じて変更される必要があり得ます。 緩衝剤およびそれらの混合物の調製<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa 2 HPO 4、および1.76 mMのKH 2 PO 4）を調製。 </li><li> 30％、50％、70％等を含有する溶液を調製しますサンプル脱水のためにPBS中hanol。徐々にエタノール濃度を増加させ、サンプルをインキュベートすることにより、試料の脱水を実行します。 </li><li> （ビスフェノールA-（エピクロルヒドリン）（20mL）中、ドデセニル無水コハク酸（9 mL）を、メチル-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸（11 ml）を混合することによりエポキシ樹脂を準備し、そして2,4,6-トリスジメチルアミノメチル）フェノール（0.7 mL）を、他の混合比は、樹脂の所望の硬度に応じて使用することができます。 </li><li>サンプル埋め込みエタノール中30％、50％、及び70％のエポキシ樹脂を含む溶液を準備します。徐々に樹脂の濃度を増加させて試料をインキュベートすることによって、樹脂の埋め込みを行います。 注：調製した溶液の体積が検討されているサンプルの種類によって異なります。以上の溶液は、細胞培養のためのより組織のために必要とされます。 </li></ol>サンプルの2.固定および着色<ol><li>遠心分離機5000×gで5分間、細胞培養。同じ条件を用いて、以下の遠心分離のすべてを実行します。</li><li>上清を捨て、4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドを含むPBS（1mL）にそれを再懸濁することにより細胞ペレットを修正。 30分（ 図1A）、室温で静置します。代わりに、一晩または週末の間、4℃で細胞を固定。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、完全に固定剤を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。 </li><li>室温で30分間、PBS中の1％のOsO 4（1 mL）でサンプルをポスト修正。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、完全のOsO 4取り除くためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。油中のOsO 4を無効化し 、廃棄します。 </li><li>造影剤としてPBS（1mL）中の2％酢酸ウラニルを追加し、室温（ 図1B）で30分間サンプルをインキュベートします。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、未結合のウラニル交流を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄etate;酢酸ウラニルは、放射性元素が含まれており、放射性廃棄物専用のビンで処分しなければなりません。 注：インキュベーション時間は、試料の大きさに応じて変更することができます。例えば、組織試料と厚い試料の固定および染色は、より長いインキュベーション時間を必要とします。より長いインキュベーション時間は、また、脱水および埋め込みステップのためのより良いかもしれません。酢酸ウラニルは、ガドリニウム塩を含む「ウラニルレス」溶液で置き換えることができます。 </li></ol> 3.サンプル・脱水<ol><li>遠心分離後、上清を捨て、30％エタノール（ 図1C）を含むPBS中で4°C（1 mL）中で30分間試料をインキュベートします。 </li><li>徐々に増加するエタノール濃度（50％、70％、および100％まで）溶液を用いて手順を繰り返し3.1。これらの脱水工程の間、サンプルの保存のために4℃で試料を維持します。 </li><li>遠心分離した後、supernatを破棄アリと純エタノール（1 mL）にペレットを再懸濁。 4℃で一晩インキュベートします。 </li></ol> 4.樹脂埋め込み<ol><li>遠心分離後、上清を破棄し、RT（ 図1D）で30分間30％のエポキシ樹脂（1 mL）でエタノール中でペレットを再懸濁します。 </li><li>徐々にエポキシ樹脂濃度（100％まで、50％、70％など）を増加させるの溶液を使用して手順を繰り返し4.1。 </li><li>遠心分離後、上清を破棄し、純粋なエポキシ樹脂（1 mL）中にペレットを再懸濁します。 RTで一晩インキュベートします。 DMP-30の硬化の存在は、樹脂の重合を誘発する可能性があります。この問題が発生した場合には、エポキシ樹脂の二つのバッチ、1とし、DMP-30のないものを準備します。 </li><li>遠心分離した後、純粋なエポキシ樹脂の200μLプラスチックカプセル内（硬化剤​​を含む）中にペレットを再懸濁。サンプルは、プラスチックカプセルの一番下にあるべきです。 </li></ol> 5.樹脂重合<ol><li>私48時間、60℃に設定したインキュベーター中でサンプルを含有するプラスチックカプセルをncubate。樹脂の他の種類は異なる設定で重合することがあります。 </li><li>インキュベーターからカプセルを外し、樹脂が重合していることを確認してください。硬い表面に押し付けた場合の樹脂は、ハードでなければなりません。 </li><li>試料を含む重合樹脂の上に（硬化剤を含む）、純粋なエポキシ樹脂を追加します。樹脂のこの余分な層は、それが簡単にサンプルをカットするようになります。 48時間60℃でカプセルをインキュベートします。 </li></ol> 6.サンプルセクショニング<ol><li>サンプルが上に向かっているように、試料ホルダ内の試料逆さまにマウントして、ウルトラミクロトームのトリミングブロックにそれを修正。しっかりウルトラミクロトームにトリミングブロックを確保するためのレバーをロックします。 </li><li>かみそりの刃または類似の鋭利な切断器具を使用して、重合樹脂からそれを分離するためにプラスチック製のカプセルを切り出します。サンプルが含まれているように、樹脂をカットピラミッドのおおまかな形状で樹脂中に編。全体プラスチックカプセルを削除する必要はありません。唯一の重合サンプルを覆っている部分を削除します。 </li><li>カプセルやトリミングブロックのオフ試料ホルダーを取り、ウルトラミクロトームの移動アームに取り付けます。 </li><li>ナイフブロックにトリミングナイフをインストールし、正確にピラミッドの顔をトリミング。双眼鏡の使用は、ピラミッドに最適な形状を与えることをお勧めします。ピラミッドより良い、より良いセクションになります。 </li><li>トリミングナイフを脱いで、0.5ミクロンよりも厚いセクションを切断するために使用することができ、組織学ナイフと交換してください。 </li><li>水の正確な量の組織学ナイフのキュベットを充填した後、試料の表面にナイフの刃先を持参し、ナイフはピラミッドに垂直にスライスするように、カプセルのピッチ角を調整するために双眼鏡を使用しています。 </li><li>希望に応じて切削速度を調整しますセクションの厚さが均一な切片を回収しました。 </li><li>水上セクションフロートをしようと、ループでそれを釣ります。 </li><li>ろ紙の上に配置された電子顕微鏡銅グリッドに向かってループを動かします。 注：グリッドは、その親水性を高めるために、以前に処理されている必要があります。これは、グリッドコーティングペンで行うことができます。 </li><li>ろ紙による水の吸収のために、セクションはグリッドに固執しましょう。電子顕微鏡に挿入する前に数分間、それが乾燥してみましょう。 </li></ol>スルー焦点チルトシリーズの7デザイン<ol><li>一定の焦点間隔でスルー焦点画像を収集します。 注：スルー焦点チルトシリーズは、チルトシリーズの各傾斜角度で収集されたスルー焦点イメージのセットで構成されています。全焦点振幅は、サンプル全体の厚さをカバーするのに十分であるべきです。 </li><li>フォーカス間隔の値を決定します。間隔がdに等しい場合epth-の視野、焦点のサンプル全体を集めます。この設定は、可能な限り最高のサンプリングを表します。間隔は、被写界深度より大きい場合、試料の一部は、サンプルの一部が焦点に収集されないことを意味し、焦点で取得されません。 </li><li>被写界深度電子の波長からの電子ビームと電子ビームの収束半角を計算します。電子の波長を直接加速電圧に連結されているのに対し、電子顕微鏡の製造業者によって提供収束半角を使用するか、または既知の試料16の回折パターンから実験的に決定します。電子は、波長λで加速するので被写界深度（DOF）を決定するために次の式を使用し、電子顕微鏡でαの収束半角でサンプルをヒット： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li>設計全体の焦点振幅がその最大見かけの厚さでサンプルをカバーするように、焦点シリーズ（ すなわち、その最高の傾きで）。 注：0.75ミクロンの厚さの試料を、70°の傾斜で2.19ミクロンの見かけの厚さを持つことになりますので、フォーカス振幅は2.19ミクロン以上でなければなりません。上記で決定したフォーカス間隔が50nmに等しい場合、このサンプルでは、​​それはその最大見かけの厚さでサンプルをカバーする44の画像（2.19ミクロン/ 50 nm）を必要とします。全焦点振幅焦点ステップの数を乗じた焦点間隔の値に等しいです。最高の傾き（θ）では、サンプル見かけの厚さは、次のように定義されます。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8.サンプル画像注：これは、STEMモードでの電子顕微鏡を設定する方法を説明するために、このプロトコルの範囲を超えています。この情報のほとんどはI見つけることができますn個のリファレンスマニュアルは、電子顕微鏡の製造元が提供します。ただし、次の点に注意してくださいⅰ）スポットサイズは、所望の倍率に応じて選択する必要があります。 ⅱ）ロンチグラムはよく整列させる必要があります。およびiii）BFモードでは、カメラの長さは、検出器の良好な照明を維持しつつ、非散乱電子を選択するように調整されなければなりません。電子顕微鏡銅グリッド上に堆積させた樹脂のセクションでは、収縮を防ぐために、画像取得の前に点灯している必要があります。樹脂の収縮と帯電効果は、画像取得の際に混乱する可能性があります。帯電効果が発生した場合、対物レンズの開口の使用は、サンプルの安定性を向上することがあります。しかし、STEMのセットアップの特定の場合には、対物絞りはHAADF撮影モードと互換性がない、と非常に小さい目的開口は、BFの撮影モードと互換性がありません。 <ol><li> （STEMで20,000前後）低倍率を使用して、サンプルを参照し、関心領域を探します。 </li><li>トンを調整サンプルを回転させながら、関心領域が離れてドリフトしないように、彼は高さ（Z軸）をユーセントリック。 </li><li>興味の対象が全体のチルト範囲全体にわたって表示されたままになりますことを確認します。 </li><li>スルー焦点チルトシリーズの間に取得された画像の実質的な数のため、自動収集ソフトウェアを使用しています。いずれかの商用ソリューションを使用するか、または希望する場合は、カスタムデータ収集ソフトウェアを設計します。ソフトウェアプログラムは、3次の手順を実行することが可能であることを確認します。 <ol><li>追跡し、標準的なチルトシリーズコレクション方式のように焦点を当てます。 </li><li>スルー焦点画像はサンプルのZ位置と重なっていることを確認してください。 </li><li>自動的に各傾斜角度におけるスルーフォーカル一連の画像を取得します。 </li></ol></li><li>ソフトウェアプログラムを介して焦点傾斜シリーズの主なパラメータ（ すなわち、焦点間隔の焦点ステップ、最小傾斜角、最大傾斜角、傾斜ステップ、および走査速度）を得ました。 </li><li>開始画像収集プロセスや仕上げにソフトウェアプログラムを待ちます。 </li></ol> 9.画像処理注：このプロトコルでは、スルーフォーカルチルト系列処理はImageJのプラグイン17を使用して実行されます。補足データ1は、アライメント工程（Turboreg）および3焦点値で設計スルー焦点チルトシリーズの合焦情報（フィールドの拡張深さ）をマージするためのImageJのマクロを示しています。 <ol><li>同じ傾斜角（ すなわち、スルー焦点画像）で収集した画像の位置を合わせます。イメージが同じで、フォーカスの情報を持っていないので、位置合わせのための同じ機能を抱いていません。 Turboreg 18、ImageJのプラグインを使用して（ すなわち、最初に最も近い焦点値で、ピラミッド型の階層を次の）近隣の画像2つずつ整列させることにより位置合わせを行います。 </li><li>一貫して、各傾斜角でスルー焦点画像の位置合わせを確認してください。目視検査を改善するために整列スルー焦点画像スタック。 注：スタックをブラウズ中にのみ焦点が合っているゾーンが移動する必要があります。次のステップは、異なる画像からピントが合っている情報の回復で構成されているので正確な位置合わせは、最も重要なことです。 </li><li>フィールド19、ImageJのプラグインの拡張深さを使用してフォーカスされている情報をマージします。これは、最終的に画像のスタックから単一の画像を生成します。いくつかの設定は、被写界深度の回復中に使用されるが、画像情報を保存するために、最高の設定を使用することができます。 注：傾斜シリーズは、現在のチルト角毎に単一の画像、スルー焦点画像から回収された合焦情報を含む各画像から構成されています。 </li><li>データを処理します。 注：データは現在、標準的なチルトシリーズに還元されているので、アライメント・復興のための標準ツールを使用することができます。このプロトコルでは、TomoJは私たちですデータのアライメントおよびデータ再構成20、21のためのエド。 TomoJを使用する方法についての詳細は、元の出版物22に記載されています。 </li><li>チルトシリーズのファインアライメントを実行します。 注：良い戦略を正確に画像間のシフトを追跡するための基準マーカーとしての金のビーズを使用することです。金ビーズをサンプルに添加することができない場合、極小値を使用することもできます。 </li><li>整列されたデータの3D再構成を実行します。いくつかのアルゴリズムは、利点と制限が各実空間またはフーリエ空間に再構成を行うために利用可能です。 </li><li>チルトシリーズの最終的な位置合わせが悪い場合は、最初の手順を最適化することにより、いくつかの改善を行います。最終的な3D再構成がぼやけたり変形していると思われる場合は、アライメントの手順を繰り返します。実際には、収集した焦点面のより多くの、より良いコントラストと3D再構成の詳細。 注：セveralソフトウェアプログラムを介して焦点チルト系列を処理するために使用することができます。しかし、このプロトコルで使用されるツールが選ばれたので、私たちの経験では、彼らは最高の行わ。 Turboreg 18は、フォーカスの勾配が存在したときに画像を整列させるという点で優れた性能を発揮しました。さらに詳しい情報は専用ウェブサイト23上で見つけることができます。他のツールは、可視ピクセルの変更が生じたのに対し、フィールドのプラグイン19の拡張深さは、異なる画像からの合焦情報を回復するという点で非常に好調に推移しました。詳細については、特にに関するスクリプトの書き込みは、この専用のウェブサイト24上で見つけることができます。 </li></ol>

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We have no conflict of interest to disclose.

この記事では、スルー焦点断層撮影STEMを使用して厚い生物学的サンプルに3D解析を実行するためのステップバイステップのガイドと一緒に、従来の試料調製プロトコルを提示します。生体試料の樹脂埋め込みが何十年26のために使用されており、試料の異なる種類に適合される代替のプロトコルは文献27を通して見ることができます。対照的に、スルーフォ...

1970年代初頭以来、断層撮影法は、広く、生物学的標本1、2、3の構造の特徴付けのために使用されてきた透過型電子顕微鏡（TEM）に近づきます。透過型電子断層撮影法の魅力は、細胞の構造および細胞小器官の超微細構造の巨大分子複合体およびタンパク質の構造に、ナノメートルスケールでの生物学的構造の広い範囲を研究するために使用することができるということでした。それにもかかわらず、透過型電子断層撮影法は、非常に厚い試料（0.5μm以下）を研究するために使用することができませんでした。実際、厚い標本は、低い信号対雑音比（SNR）の画像を生成し、あまりにも多くの散乱電子を生成します。さらに、断層撮影法は、試料の見かけの厚さが、傾斜角の増加と共に、傾斜片の画像のコレクションを含みます。非弾性散乱をフィルタリングすることができるにもかかわらずエネルギーフィルタを用いて、高SNR画像のために必要な電子の臨界量はほとんどTEMに達しました。したがって、厚い生体試料は、わずか4を区画用いて研究されてきました。 それらが切断されたときにいくつかが低下する可能性があり、他はその複雑さを理解するために、その全体で検討する必要がありますいくつかのサンプルをスライスすることはできません。別のアプローチは、走査モード5、6、7、8のTEMを使用することです。透過電子顕微鏡（STEM）の走査において、電子の光路は、従来のTEMと異なります。弾性散乱ものは暗視野（DF）検出器を光軸からある角度で収集することができ、一方、散乱せずに試料を通過する電子は、明視野（BF）検出器9との光軸上に集めることができます。STEMの他の利点は、集束電子ビームは、画像のピクセルごとの収集を可能にする、試料の表面で走査されることです。サンプル10を通過しながら電子ビームを広げても、この特定の収集方式は、従来のTEMより非弾性散乱電子の影響を受けにくいです。また、これにより、TEMで発生する可能性が色収差を回避STEMにはレンズ後の試料​​は、ありません。 BF検出器は、主に非散乱電子を検出するようにカメラの長さを調整することができます。厚い試料を研究するためにDF検出器を使用することであるため、不正確な画像を生成する多重散乱、お勧めできません。代わりに、BF検出器11を使用することができます。 STEMは、高SNR画像を生成することができるが、それは厚いから回収することができる詳細な情報の量を減少させる、ためTEMに比べて比較的高いビーム収束比較的低い被写界深度を有します標本。フォーカスされている情報は、わずか数ナノメートルの焦点面に由来するように、輻輳角は30ミリラジアンと高くすることができ、収差補正STEM顕微鏡の場合には、被写界深度が十分に低くすることができ。パラレルモードでは、電子ビームを設定する分解能12の犠牲に被写界深度電子ビームを高めます。しかし、この設定は常に可能ではありません。 それは収束電子ビームを使用する必要があるたびに厚い試料を研究するとき、人は被写界深度電子ビームを高める技術を使用しなければなりません。最近の研究では、合焦情報13、14の最大量を回収するために、試料の様々な焦点面における複数の画像の取得を報告しています。二つの研究は、異なる焦点面からの情報を処理するためのさまざまな方法について説明します。ホーブデンら。様々な焦点面で収集した画像は、フーリエ空間で組み合わせ、最終再構成13を変換次元逆フーリエ変換から直接得ました。対照的に、ダーメンら。実空間内の様々な焦点面14から3Dボリュームを再構成する収束ビーム再構成エンジンを開発しました。私たちの研究室でも厚い生物学的標本を画像化するための方法を開発しました。当社の戦略は、我々は、様々な焦点面にフォーカスされている情報をマージして平行ビームプロジェクター15を用いて、実空間での最終3Dボリュームを再構築し、その中に上記の二つの方法は異なっていました。私たちの目的は、簡単に任意の電子顕微鏡研究室で行うことができる方法を開発することでした。この目的のために、我々は、従来の断層撮影実験の時間枠に相当する時間の限られた量で焦点画像を収集することを目的としました。また、提案手法のC整列および再構築ソフトウェアの異なるタイプで使用するために適合されウルド。 2015年15から私たちの出版物の文脈において、我々は、被写界深度の回復を可視化し、特徴づけるために望んでいたので、私たちは25 mradでの大規模な収束半角を使用しました。ここでは、2015年15で私たちの研究室で開発された方法に従って、STEMにスルー焦点イメージングを実行するためのステップバイステップのプロトコルを提示し、我々は2015年からのデータが処理された方法を提示します。この方法は、厚さ（750 nm）の生物学的サンプル中の複数の焦点面からの合焦情報を回復し、高品質の3D再構成を可能にします。該当する場合、他のグループによって使用される方法に対するこの方法論の違いも提示されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &#176;C. 
			Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin Capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triming and Histo knives</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>Diatome diamond knives</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy copper grid</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Pen</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>70624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Holder</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EM-21311 HTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

我々の研究では、電子が電界放出銃の透過型電子顕微鏡で200 kVのに加速しました。画像は、20マイクロ秒の滞留時間を用いてSTEMのBFモードで収集しました。スルー焦点チルトシリーズのデザインに関しては、我々は750nmの厚さの生物学的サンプルであっても、電子ビームの被写界深度があったものののみの超微細構造研究のために満足のいく結果が得られた150nmでのフ?...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K ビュー.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

ビデオ: Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

生物学

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...