この研究は、Fondazione Bambino GesùおよびRicerca Corrente(イタリア保健省)からC.C.への助成金によって支援されました。 エンリコ・ベルティーニ博士(バンビーノ・ジェズ小児研究病院分子医学研究所神経筋・神経変性疾患ユニット神経科学部)、ステファニア・ペトリーニ博士(バンビーノ・ジェズ小児研究病院研究所共焦点顕微鏡中核施設)、ジュリア・ペリコリ博士(バンビーノ・ジェズ小児研究病院腫瘍血液学・遺伝子・細胞治療科) ロベルタ・フェレッティ(腫瘍血液学、遺伝子および細胞療法、小児研究病院バンビーノジェズ)の 科学的議論と技術的支援。マリアヴィンチは、「小児がん英国フェローシップ」の受賞者です。

1. 96ウェルプレートのコーティング
注:異なるコーティングは同じプレートでテストされましたが、別々のウェルでテストされました(補足ファイルを参照)。
<ol><li>マトリゲルをDMEMで1:100に希釈します。96ウェルプレートに1ウェルあたり100 μLを加え、室温で1時間インキュベートします。これに続いて、溶液を取り出し、100 μLのDMEMでウェルを2回洗浄します。</li>
	<li>ラミニン(20 μg/mL、LN-521)をPBS(カルシウムおよびマグネシウムを含む)で希釈します。ウェルに100 μLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、細胞を播種する前にDMEMで2回の洗浄を行う。</li>
	<li>ビトロネクチン(10 μg/mL)を希釈バッファーで希釈します。ウェルあたり100 μLを96ウェルプレートに加え、室温で1時間インキュベートします。細胞をプレーティングする前に、PBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)でウェルを洗浄します。</li>
	<li>HU-フィブロネクチン (30 μg/mL) を ddH2O で希釈し、100 μL をウェルに加え、室温で 45 分間インキュベートします。これに続いて、細胞を播種する前に培地でウェルを洗浄する。</li>
</ol>2. 培養におけるiPS細胞の維持
注:iPS細胞は商業的に購入されました。iPS細胞は健康なヒト線維芽細胞に由来し、エピソーム技術を使用して再プログラムされました。
<ol><li>-80°Cの冷凍庫または液体窒素から、凍結保存されたiPS細胞を37°Cの水浴中で解凍します。細胞を含むバイアルを70%エタノールで洗浄してから、生物学的安全キャビネットに移します。</li>
	<li>細胞懸濁液を、15 mL滅菌コニカルチューブ内の1000 μLピペットで、事前に温めた5 mLの細胞培養培地(mTeSR1など)に一滴ずつ加えます。</li>
	<li>細胞を304 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。</li>
	<li>培地を取り出し、細胞ペレットを4 mLの細胞培養培地に再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液を6ウェルプレートの2つのウェル(6ウェル細胞培養皿あたり10個の5 iPS細胞)にプレートし、マウス胚性線維芽細胞(MEF)が以前に播種されています。iPS細胞を2.4 x 104/cm 2の密度でDMEM(10%ウシ胎児血清、1%L-グルタミン、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)で播種する2 日前にMEFを播種します。</li>
	<li>播種後、細胞培地に10 μMのROCK阻害剤Y-27632を補充します。</li>
	<li>最初の4〜5週間はMEF上でiPS細胞を増殖させ、その後、mTeSR1の目的のコーティングの1つ(ステップ1および 表1を参照)を使用して、フィーダーフリー条件(MEFフリー条件)で成長させます。</li>
	<li>iPS細胞が70〜80%コンフルエントな場合は、0.5 mM EDTA処理を用いてRTで3〜5分間1:4で継代し、6ウェルプレートに0.5 mM EDTAを1 mL加えます(他のタイプのプレートの場合は比例量)。フィーダーフリーの条件で新しいウェルに移し、37°C、5%CO2、20%O2でインキュベートします。</li>
	<li>毎日新鮮なmTeSR1で培地を交換し、2日ごとに細胞を分割します。</li>
</ol>3. 細胞コンフルエンスの特性評価
<ol><li>実験には96ウェルプレートを使用してください。</li>
	<li>MEFが継代されなかったことを確認するために、フィーダーフリー条件で少なくとも1ヶ月培養した後、ウェル当たり10,000個の細胞を播種する。使い捨ての計数スライドを使用して、光学顕微鏡で細胞を数えます。</li>
	<li>3連で実験を行います。したがって、3つのウェルで各播種条件をテストします。</li>
	<li>播種後1日目から明視野モードでサイトメーターを使用して自動画像取得を実行します。24時間ごとに5日間、自動画像取得を実行します。実験パラメータの詳細については、 補足ファイルを参照してください。</li>
	<li>自動コントラストと自動露出を使用して、細胞をより適切に視覚化します。</li>
	<li>ウェルの境界での光の屈折による焦点の変化を評価するために、ウェルあたり60%、80%、および100%のマスクを適用するように、合流点解析の解析設定(「 補足ファイル」を参照)を設定します。上記の異なるマスク解析設定を使用して、各時点での細胞コンフルエンスを解析します。</li>
</ol>4. 統計分析
<ol><li>定量的結果を平均の標準誤差±平均(SEM)として報告します。</li>
	<li>異なるコーティング条件の全体的な違いを比較するには、同じサンプルを使用してデータを取得し、スチューデントの対応のあるサンプルのt検定を実行します。 0.05未満のp値は統計的に有意であると見なされ、報告されたすべての p値は両側です。</li>
</ol>5. 細胞骨格マイクロフィラメントの特性評価
<ol><li>細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒド(4%PFA)でRTで10分間固定した後、PBSで2回洗浄します(合計10分)。</li>
	<li>100 μLのブロッキング溶液(5%BSA、PBS中の0.1%トリトンで構成)を各ウェルに添加し、RTで1時間行います。</li>
	<li>ブロッキング溶液を除去し、サンプルをPBSで10分間2回洗浄します。</li>
	<li>サンプルあたり100 μLのファロイジンコンジュゲート作業溶液を加え、RTで1時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞をPBSで2回洗浄します(RTで10分)。</li>
	<li>PBSで1:10000に希釈したHoechst 33342で核をRTで10分間染色します。</li>
	<li>ヘキスト溶液を取り除き、毎回10分間PBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>サンプルをH2Oで洗浄し、化学フードの下で乾燥させます。</li>
	<li>100 μLの封入培地(PBS:グリセロール、1:1など)を加えて細胞を覆い、サンプルの蛍光を維持します。</li>
	<li>白色光レーザー(WLL)光源と405 nmダイオードレーザーを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡で、Ex/Em 493/517 nmの細胞を観察します。HC PLAPO 40倍油浸対物レンズを使用して、連続した共焦点画像を取得します。検査するすべてのサンプルに同じレーザー出力、ビームスプリッター、フィルター設定、ピンホール直径、スキャンモードを使用します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis.">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li><li>Kleinman, H. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation,+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li><li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells.">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li><li>Bergstr&#246;m, R., Str&#246;m, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li><li>Braam, S. 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著者は開示するものは何もありません。

iPS細胞は、疾患モデリングや将来の創薬スクリーニングに利用され、精密医療への応用も視野に入れており、胚性幹細胞の生理的状況により近いin vitro培養条件を明確に理解する必要があると考えています。これに関連して、細胞が健康で未分化な状態を維持できる条件を理解するために、野生型iPS細胞を使用してさまざまなECMコーティングをテストしました。これに加えて、重要な点は、MEFとマトリゲルの異種成分でのiPS細胞の培養であり、これは三重の実験的変動性を説明する可能性があり、これは機構研究を行う能力を妨げます26。
本研究では、異種フリー基質(LN-521、ビトロネクチン、Hu-フィブロネクチン)上でのiPS細胞のコンフルエントを、ハイコンテント画像解析サイトメーターを用いて試験しました。自動画像解析システムを使用する理由は、細胞をカウントし、トリパンブルー排除法を使用すると、単一細胞懸濁液を作成する必要があり、iPS細胞を操作する場合は、細胞死を避けるために細胞クラスター内で増殖する必要があるため、推奨されないためです。ハイコンテント画像解析で得られたデータにより、細胞を乱すことなく細胞のコンフルエントを追跡することができ、毎日5日間画像化することができます。この技術は、iPS細胞株の特性評価方法として考えられ、ヒトiPS細胞の品質制御パネルを実行するために含めることができます。ここでは商用のソフトウェアパッケージを使用しましたが、ここで説明する方法論は、同等のハイコンテント/ハイスループット画像解析プラットフォームおよび同様の解析ソフトウェアパッケージによって正常に使用できます。得られたデータは、LN-521に播種されたiPS細胞が、細胞を分裂させることなく培養中の5日間に直線的な合流を示すため、この研究でテストされた最高の異種フリー基質であることを示しています。このプロトコルの1つの制限は、異なる基質へのiPS細胞結合の違いを考慮するために、得られた結果を最初の時点に正規化する必要があることです。興味深いことに、得られたデータは、LN-521へのiPS細胞の細胞付着率の増加によって駆動される可能性が最も高いです。実際、最初の時点の結果を正規化するとき、異なる基質間で違いは観察されません。
今回の研究で得られた結果から、細胞とECMの接触を媒介し、特定の細胞種への自発的な分化ではなく、自己複製能の維持に関与する可能性のある主要な細胞表面受容体を知るという点で、多能性幹細胞の生物学をよりよく理解することは興味深いでしょう。興味深いことに、培養表面のマトリックスの弾力性が異なる細胞型への分化に影響を与えたことを示す研究があり、これはおそらく、細胞型特異的分化に関連する細胞内細胞シグナル伝達経路を活性化した細胞-ECM相互作用に依存しています27。これに加えて、Vigilanteら28 は、計算的アプローチと遺伝子発現および細胞生物学データセットを組み合わせることにより、iPS細胞の挙動の変化に対する遺伝的寄与を調査しました。したがって、Vigilanteら28 による研究は、遺伝的変異を表現型変異にマッピングしようとする試みにおける大きな進歩です。これらの研究は、iPS細胞の将来の臨床での使用の可能性に照らして、iPS細胞実験を行うために使用される標準化された方法論の開発につながる可能性があります。

人工多能性幹細胞(iPSC)は体細胞から得られ、異なる細胞型に分化することができる。それらは、疾患の病因をモデル化したり、薬物スクリーニングを実行したりするためのシステムとしてよく使用され、個別化医療のコンテキストで使用される可能性も提供します。iPS細胞は大きな可能性を秘めているため、信頼性の高いモデルシステムとして使用するために、iPS細胞を完全に特徴付けることが重要です。我々は以前、低酸素環境でiPS細胞を増殖させることの重要性を示しましたが、これらの細胞は解糖に依存しており、好気性環境は酸化還元の不均衡を引き起こす可能性があるためです1。iPS細胞は、他の培養条件、特に細胞外環境に対しても脆弱です。培養条件の最適化は、それらを健康で増殖させるための重要な問題です。健康なiPS細胞培養は、特定のヒト疾患または細胞プロセスの分子、細胞および機能的特徴を理解するために使用されるモデルのエンドポイントである健康な分化細胞につながります。
この研究では、簡単なプロトコルを使用して、別々のウェルで異なるコーティング条件を使用してiPS細胞の合流点をテストしました。iPS細胞は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)を適切に付着させるためにフィーダー層を必要としますが、iPS細胞とMEFが共存しているため、2つの細胞集団が存在するため、RNAやタンパク質抽出などの解析が困難です。フィーダー層を回避するために、細胞外マトリックス(ECM)に属するさまざまなタンパク質を使用して、天然の細胞ニッチを再現し、フィーダーフリーのiPS細胞培養を行ってきました。特に、マトリゲルは、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜製剤であり、細胞外マトリックスタンパク質(ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン/ニドゲン、成長因子)が豊富に含まれています2,3。他の使用されるコーティング条件は、代わりにECMの構築に既知の関連性を有する精製タンパク質である:ラミニン-521は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)によって胚の内部細胞塊に分泌されることが知られており、出生後の体内で最も一般的なラミニンの1つである4,5,6,7,8,9、10,11;ビトロネクチンは、hPSC 12,13,14,15,16の増殖と分化をサポートすることが知られているゼノフリー細胞培養マトリックスです。フィブロネクチンは、脊椎動物の発生および多能性状態の胚性幹細胞の付着および維持に重要なECMタンパク質である17、18、19、20、21、22、23、24、25。異なるコーティング条件が利用できるため、iPS細胞の合流性への影響の観点からそれらを比較します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1123">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:589px;">10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile</td>
			<td style="width:281px;">Corning</td>
			<td style="width:77px;">4488</td>
			<td style="width:176px;">Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">1x PBS (With Ca2+; Mg2+)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">1x PBS (without Ca2+; Mg2+)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Support</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture plate, 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Support</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium- high glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED4SS-500g</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A15960</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FAST - READ 102</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>BVS100</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>FC010</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">H2O</td>
			<td></td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33342</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin 521</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>77003</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS25030081</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>354277</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:589px;">Mouse embryonic fibroblasts (MEF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTESR1 Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTESR1 Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitronectin</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7180</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the confluence of ipscs using an automated imaging system

この研究は、異なるECMコーティング基板上でiPS細胞を増殖させることが細胞のコンフルエントにどのように影響するかを理解することに焦点を当てています。iPS細胞コンフルエンスをリアルタイムで評価するプロトコルが確立されており、増殖の摂動を避けるために単一細胞懸濁液中の細胞をカウントする必要はありません。ハイコンテント画像解析システムを使用して、4つの異なるECMのiPCS合流を経時的に自動的に評価しました。接着性iPS細胞の細胞コンフルエンスを評価するために異なる分析設定が使用され、60、80、または100%のマスクが適用されたかどうかは、わずかな違い(ラミニンで24時間および48時間)のみが観察されました。また、ラミニンがマトリゲル、ビトロネクチン、フィブロネクチンと比較して最良のコンフルエントにつながることも示しています。

本研究では、異なるコーティング条件で成長させた場合のiPS細胞コンフルエントを調査しました。サイトメーターを使用すると、5日間で3回ですぐに有益な結果を得ることができました。iPS細胞はプラスチック容器に付着しにくく、増殖をサポートするためにコーティングが必要であるため、ヒトiPS細胞の合流性は細胞培養の健全性を示し、分化能を反映する可能性があるため、モニタリングすることにしました。in vitro増殖後、iPS細胞を異なるECM基板上に播種し、明視野で取得したサンプル画像を観察し、ファロイジン染色(アクチンフィラメントの染色に使用、F-アクチンとも呼ばれる)を使用して細胞を分析し、血管への接着を理解しました(図1)。実際、ファロイジン染色により、血管の表面、したがって血管に使用される特定のコーティングへの細胞接着の程度を視覚化できます。コーティングに接着している細胞は、崩壊したマイクロフィラメントの代わりにはっきりと見える細胞骨格マイクロフィラメントを示した。ファロイジン染色と組み合わせた明視野の観察は、コーティングされた表面へのiPS細胞の良好なレベルの接着を文書化します。
コンフルエントを調べるために、iPS細胞にマトリゲル、LN-521、ビトロネクチン、Hu-フィブロネクチンを3回播種し、実験を3回行いました。ウェルの端による光の屈折を避けるために、60、80、100%のマスクで3種類の解析設定を適用し、細胞のピッキングとバックグラウンドの回避が類似していることを観察しました(図2)。得られた結果は、LN-521に播種されたiPS細胞が、他のコーティングと比較して、時間中に直線的に高い細胞増殖率を示し、これらの差が統計的に有意であることを示しています(図3のアスタリスクA-C)。マトリゲル、ビトロネクチン、またはHu-フィブロネクチンに播種された細胞は、最初の96時間で線形増殖率を示しますが、最後の24時間でコンフルエンス曲線の傾きの増加も示します(使用したマスクとは無関係に、60%、80%、または100%、図3A-C)。異なるコーティングの24時間での最初の違いは細胞付着の違いによるものである可能性があるため、細胞増殖は後の時点(48時間から120時間)で24時間に正規化されています(図3D-F)。60、80、および100%マスクを使用して得られたグラフは、異なるコーティング間の合流点に関して違いがないことを示しており、LN-521で観察された違いは、継代時にiPS細胞がこのコーティングに付着する能力の増加による可能性が最も高いことを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61225/61225fig1.jpg"> 図 1.3日後に異なるECMコーティングに播種したiPS細胞の代表的な明視野画像とファロイジン染色。使用したコーティング上で細胞が健康であり、明らかに見える細胞骨格マイクロフィラメントを示すファロイジン染色によって文書化されているように、細胞が血管に良好に付着していることを示す明視野画像。スケールバー:25μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61225/61225fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61225/61225fig2.jpg"> 図 2.合流解析の実行に使用したマスクの3つの異なる解析設定を示す代表的な明視野画像。明視野画像(96ウェルプレートから16画像/ウェル)を用いてサイトメーターで得られたモザイク。緑色の分析セグメンテーションは、ウェルの丸いエッジを回避または含めるために適用されたさまざまなマスク(60、80 100%)を明確に表示します。スケールバー:500μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61225/61225fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61225/61225fig3v2.jpg"> 図 3.異なるコーティング容器に播種したiPS細胞の細胞コンフルエンス解析。異なるコーティングされた血管に播種したiPS細胞の細胞コンフルエントを表すグラフ。データは、(A)60%マスク(B)80%(C)100%を用いて適切なソフトウェアで5日間(120時間)取得した後に解析した。第1の時点(24時間)までの48時間〜120時間の合流点の正規化は、(D、E、F)に示される。データは3つの独立した実験から得られた。データはSEM±平均値として表される。 n= 3 * p<0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61225/61225fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>コーティングコンパウンド</td>
			<td>初期濃度</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr><tr><td>HU-フィブロネクチン</td>
			<td>1ミリグラム/ミリリットル</td>
			<td>10 μg/cm2</td>
		</tr><tr><td>ラミニン521</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>20 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>マトリゲル</td>
			<td>*</td>
			<td>0.111111111</td>
		</tr><tr><td>ビトロネクチンXF</td>
			<td>250 μg/mL</td>
			<td>10 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>表 1. 合流点の分析に使用したコーティング化合物のリスト。 使用されるさまざまなコーティングの名前、初期濃度、最終濃度が報告されています。*マトリゲルの初期濃度は、バッチによって異なります。
補足ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61225/61225_R1_Supplemental_file.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

このプロトコルの目的は、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)コーティング条件を比較して、差動コーティングが人工多能性幹細胞(iPSC)の増殖速度にどのように影響するかを評価することです。特に、iPS細胞培養の最適な増殖を得るための条件設定を目指しています。

自動イメージングシステムを用いたiPS細胞の合流点の測定

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

measuring-the-confluence-of-ipscs-using-an-automated-imaging-system

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

1.9K ビュー.  Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS. このプロトコルの目的は、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)コーティング条件を比較して、差動コーティングが人工多能性幹細胞(iPSC)の増殖速度にどのように影響するかを評価することです。特に、iPS細胞培養の最適な増殖を得るための条件設定を目指しています。

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Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

切断者のためのOsseointegratedインテリジェントインプラント設計システムの生体電気分析

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

生物学

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

上の細菌の影響を測定する<em&gt; C.エレガンス</em卵保持アッセイを用いて&gt;行動

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.