ACE は最適なイメージングのサイトです。移植状況におけるそれらの機能および生存率を研究するために、長期間インビボでのイレット細胞イメージングでそれを繰り返すことを支持する。また、リアルタイムで生理学的および病理学的条件下で他の側面を研究するために拡張することができます.
ACE技術の利点は、同じ個々のヒト膵島が長期間にわたって細胞下解像度で非侵襲的に追跡することができるという事実にあります。ベータ細胞補充療法の成功率は改善し続けている。しかし、インビボでのイレット移植および生存の効率を評価することは依然として困難である。
この方法は、小子移植の結果を評価し、最適化するのに役立つ可能性があります。このアプローチは膵島のみに限定されません。また、影響を受ける組織を研究するのに適しています。
例えば、糖尿病性合併症では、腎臓糸球体や肝臓片のような、ほんのいくつかを挙げるように。温かい加熱パッドの上にマウスを置き始めるには、ヘッドホルダーに置き、ノーズマスクに置きます。親指と人差し指を使って頭を少し持ち上げます。
側面に金属片を付けて留めます。耳の部分が耳の真下に頭を固定することを確認します。マウスの背面にブプレノルフィン溶液を皮下注射する。
鈍い鉗子を使用して移植される眼のまぶたを穏やかに引き込む。目を飛び出し、ポリテーンチューブで覆われたピンセットでゆるく固定します。PBSでまぶたをペトリ皿に移した後、目のカナラに約20〜30個の小島を拾います。
25ゲージの針レベルを上にして、慎重に先端を角膜に挿入し、単一の横切開を行います。カニューレをプリロードした角膜を慎重に持ち上げ、ゆっくりと小島を目に放出します。カニューレをゆっくりと引っ込め、目に目ゲルを塗布します。
10分後、鉗子を取り外し、まぶたを保持し、目を通常の位置に戻します。2つの光子顕微鏡で埋め込まれたヒト小島のイメージングのために、ヘッドホルダープラットフォームを顕微鏡の下に置き、角膜とレンズの間の浸漬液として眼に目ゲルを投与する。目的の下に目を配置し、テキスト原稿に記載されているように、埋め込まれたヒト小島を画像化します。
自己蛍光を除去するには、画像処理タブに移動し、チャンネルの算術を選択し、チャンネル1からチャンネル2を引いたものを入力します。これにより、新しいチャネル 4 が作成されます。血管系の名前を変更します。
このプロセスを繰り返し、チャネル 3 マイナス チャンネル 2 を入力して新しいチャンネル 5 を作成し、トマトの名前を全て変更します。この小水を定義するには、手動で新しいサーフェスを作成し、ウィザードで手動で編集を選択します。ポインタを選択モードと 3D ビューに保持します。
そして、セクションを視覚化するボリュームをクリックします。図面タブで輪郭を選択し、[描画]をクリックして、スライス位置1から、小地の境界線の周りに輪郭を描き始めます。次に、新しいスライス位置に移動し、描画の輪郭を繰り返します。
最後のスライスを小水の上部に置き、最後に [サーフェスの作成] タブをクリックします。次のセグメントは、アイレットマスクを用いたバレーバレーの脈管及びトマトの蛍光である。以前に定義したアイレットマスクオブジェクトを選択し、編集タブに移動してマスクの[すべて]タブをクリックすると、新しいウィンドウが開きます。
チャンネル選択ドロップダウンメニューで血管構造チャンネルを選択し、マスクを適用する前にオプションの重複チャンネルをアクティブにします。内部、外側、および新しいチャネル 6 を作成する 0.000 に外側のボクセルを設定します。このチャンネルの小口血管構造の名前を変更します。
前の手順を繰り返し、チャンネル選択ドロップダウンメニューでトマトをすべて選択し、新しいチャンネルを作成し、名前を変更し、トマトを選択します。次に、シーンメニューで新しいサーフェスを作成し、ウィザードで自動作成を選択します。ソースチャネルを以前に作成した小海峡の脈管構造に設定し、背景減算を選択します。
オプションでフィルターを使用します。たとえば、ボリュームを選択し、選択したサービスオブジェクトを削除できるウィンドウでフィルターを調整します。ウィザードを終了し、新しいサーフェス オブジェクト、小地の血管構造に名前を付けます。
「小州脈管構造」サービスオブジェクトで編集タブに移動し、マスクの[すべて]タブをクリックすると、新しいウィンドウが開きます。チャンネル選択ドロップダウンメニューでアイレットトマトチャンネルを選択し、新しいチャンネルを作成する10.000に表面外のボクセルを設定します。このチャンネルの小口トマト血管系の名前を変更します。
トマトカプセル蛍光信号をセグメント化するには、画像処理タブでチャンネルの算術を選択し、チャネル7マイナスチャンネル8を入力して新しいチャンネルを作成します。トマトカプセルの名前を変更します。前に説明したように新しい表面を作成し、ソースチャンネル、ウィザードでトマトの血管またはトマトカプセルを選択します。
次に、バックグラウンドの減算を実行します。小子の後方散乱ファイルを開き、新しいサーフェスを作成します。ウィザードで、自動作成を選択し、対象の領域を定義します。
必要に応じて、しきい値を絶対強度で調整します。サーフェス オブジェクトは、クリックしてオンまたはオフにして、対応するチャネル強度とクロスチェックできます。完了したら、ウィザードを閉じます。
最後に、定量を実行し、シーンメニューで作成したサーフェスオブジェクトを選択して、統計情報タブに移動します。詳細なボリュームデータを取得するには、詳細タブを選択し、ドロップダウンメニューから特定の値とボリュームを選択します。合計ボリューム値を取得するには、詳細タブに移動し、平均値を選択します。
このプロトコルは、8週齢の雌の赤い蛍光レシピエントマウスの眼の内部チャンバーに非標識ヒト小島を移植するために使用された。その後、インタラクティブイメージングソフトウェアを使用して、画像から定量的なデータを抽出しました。生体内フルオレセンス画像では、マウスの小子移植片では観察されなかった組織自己蛍光からの有意な干渉によってヒト小口移植片が損なわれた。
信号対雑音比を改善するために、自己蛍光チャネルを減算した。その後、アイレットマスクと呼ばれる小子の境界と対応するチャネルを手動で定義しました。最後に、トマト信号を眼瞼の血管構造および眼瞼カプセルへのセグメンテーションと最終表面レンダリングを使用して定量的データを抽出した。
ここでは、移植後2週間、2ヶ月、5ヶ月および8ヶ月で同じヒト小島移植片の代表的な縦断画像セッションとして。もともと記録された生データのMIP画像、小子自家蛍光除去後の処理画像およびセグメント化された小子オブジェクトが示されている。まぶたの注入を行う場合は、小さなボリュームで小島をプリロードし、ステレオ顕微鏡に柔軟なツインライトアームを使用して、ACEに島を正常に注入するために眼室スペースを強調してください。
インビボイメージングに続いて、眼を固定し、抗体染色および従来の構造学についてさらに調査することができる。この技術は、特に血管化、生存率および代謝研究の文脈において、リアルタイムおよび生理学的条件下での個々のヒト小島の機能研究に非常に有用である。
