このプロトコルは、自己免疫攻撃に対する防御のメカニズムを理解し、1型糖尿病におけるベータ細胞置換の治療標的を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、比較的低コストで、細胞培養、移植、およびイメージング方法の単純さ、ならびにマウス技術の侵襲性が低いことです。これまで尾静脈注射を行ったことがない人は、針を静脈に挿入するのに苦労する可能性があります。
最初の注射の前に専門家によるデモンストレーションを依頼してください。まず、麻酔をかけたマウスを取り、ガード付きの電気シェーバーを使用して背側から髪を取り除き、約1インチ×2インチの皮膚を露出させます。剃ったマウスをノックダウンチャンバーに戻します。
移植の前に、一度に1匹のマウスをチャンバーからイソフルランノーズコーンを備えたきれいな表面に移し、マウスの頭をノーズコーンにそっと導きます。剃った部分をイソプロピルアルコール準備パッドで拭いて、抜け毛を取り除き、皮膚を消毒します。次に、300マイクロリットルを超える細胞懸濁液を、26ゲージの針を取り付けた1ミリリットルの滅菌シリンジに引き込みます。
シリンジから気泡を取り除き、余分なものを押し出しながら300マイクロリットルの細胞懸濁液を保持します。利き手ではない手に持った一対の湾曲した鉗子を使用して、マウスの背中の片側の皮膚をそっと持ち上げて、皮下スペースへのアクセスを容易にします。次に、利き手を使用して、シリンジをマウスの体の冠状および矢状平原と平行に配置します。
針をマウスの頭に向け、後肢近くの皮膚に挿入し、針全体が皮膚の下に残り、突き出ないようにしながら皮下空間に導きます。鉗子を調整して、針の付け根の周りに皮膚を保持します。50マイクロリットル未満の細胞懸濁液をゆっくりと分注し、注射部位の皮膚の下に小さな膨らみが形成されることを確認します。
最大200マイクロリットルの細胞懸濁液を皮下注射し続ける。次に、鉗子を所定の位置に保持し、針をマウスの体と平行に保ち、針を引き抜きます。針を外したら、細胞が穿刺創から漏れないように、鉗子で皮膚を数秒間閉じたままにします。
移植後、各マウスを新しいケージに移し、動物が麻酔から完全に回復してから、ケージにマウスを追加します。安楽死させたマウスを背中に置き、外科用ハサミを使用して、皮膚に約2インチの長さの垂直切開を行います。マウスの右側を切り開き、真っ赤な脾臓を見つけます。
ピンク色の膵臓から脾臓をそっと切り取り、5ミリリットルの滅菌PBSを含む滅菌10センチメートルのペトリ皿に移します。滅菌注射器プランジャーの平らな上部で脾臓をマッシュします。40または70ミクロンのストレーナーを50ミリリットルの円錐形のチューブに置き、5ミリリットルのPBSでプライミングします。
脾臓懸濁液をストレーナーに移し、穏やかにマッシュします。10ミリリットルのPBSで皿を洗い、洗浄液をストレーナーに移します。ストレーナーに赤い色がなくなるまでマッシュを続けます。
その後、チューブを室温で500Gの速度で5分間回転させ、吸引ピペットで上清を除去してから、室温に予め加温した5ミリリットルのACK溶解バッファーに細胞ペレットを再懸濁し、室温で4分間赤血球の溶解を行った。5ミリリットルの溶解バッファーあたり5ミリリットルのNIT-1細胞培地で反応を停止し、細胞懸濁液を新しいストレーナーを通して50ミリリットルの遠沈管に入れて塊を取り除きます。チューブを500 Gで室温で5分間回転させます。
次に、細胞をカウントする前に、細胞ペレットを20ミリリットルのPBSに再懸濁します。カウントした後、室温で5分間500 Gでセルをスピンダウンします。細胞ペレットを滅菌PBSの1.5ミリリットルのセーフロック反応チューブに再懸濁します。
すぐに注入するか、細胞を氷上に最大1時間保管します。成体レシピエントNOD SCIDマウスの体を、ヒートランプを使用して5〜10分間温め、静脈を血管拡張します。各注射の前に脾細胞溶液を再懸濁します。
各マウスについて、100マイクロリットルの予め温めた脾細胞懸濁液をシリンジに引き込み、気泡が存在しないことを確認する。次に、マウスを拘束装置に入れてから、利き手ではない手で尻尾をキャプチャします。2つの外側尾静脈の1つを見つけます。
必要に応じて尾をゆっくりと回転させます。70%イソプロピルアルコールを含む消毒用ワイプで尾を拭きます。利き手を使用して、針を尾の中央領域に鋭角に挿入します。
針の斜角を上に向けて、針を皮膚に数ミリメートルスライドさせます。次に、注射器に穏やかな圧力を加えて、脾細胞懸濁液を注入します。注射時に針をさらに出し入れしないでください。
成功した注射は注射中に背圧を引き起こさず、注射直後に透明または白色の血流によって示されます。注射後、針を静脈からそっと外し、出血が止まるまで消毒用ワイプで尾に軽い圧力をかけます。マウスを拘束装置から離し、準備したてのケージにそっと移します。
イメージングの少なくとも5分前に、1ミリリットルの注射器と26ゲージの針を使用して、適切な用量のD-ルシフェリン溶液をマウスの腹腔内注射します。イメージングソフトウェアにログインした後、コントロールパネルで[初期化]を選択します。画像データを自動保存するには、取得をクリックしてから自動保存をクリックし、コンピュータに適切なフォルダを作成します。
機器の初期化が完了したら、露光時間を1分に設定します。マウスを手足を広げた状態で腹臥位でイメージング機器に置き、頭をノーズコーンに導きます。マウスの背中の中央を両手で押してから、手を外側に広げて離して、マウスをそっと平らにします。
次に、イメージングソフトウェアで[取得]を選択し、ポップアップウィンドウに実験の関連する詳細を記録します。研究した3匹のマウスのうち2匹において、対照移植片は、それぞれの生物発光シグナルの喪失から明らかなように18日目までに破壊された。しかし、もう一方のマウスでは、対照移植片が生存している間に変異移植片が破壊され、動物間の生物学的変異が浮き彫りになりました。
生物発光シグナルを定量化し、移植片の生存率を、最初の時点でのシグナルと比較した残留生物発光シグナルの割合として報告した。各マウスの変異体移植片と対照移植片からの発光シグナルの比を使用して、動物間の変動を視覚化しました。病気の伝染の前に、移植された細胞は複製し、皮膚を通して見える拡張移植片をもたらすかもしれません。
イメージングすると、これらの移植片は、正確に定量化できなかった飽和生物発光シグナルを示しました。移植片は、自己免疫攻撃および移植片防御のメカニズムを調べるための例えばフローサイトメトリーによって浸潤免疫細胞を特徴付けるために様々な時点で単離することができる。
