この頭蓋内注射プロトコルは、脳転移のメカニズムをより効果的に研究するために、正確な注射、日々のモニタリング、正確な腫瘍体積測定を可能にするため、重要です。この技術の主な利点は、頭蓋内腫瘍の増殖の連続的なモニタリングを可能にすることである。この手順のデモンストレーションは、サイズモア研究所の大学院研究員であるジョナサン・スペハーと、オハイオ州立大学小動物イメージング共有資源のイメージング研究科学者アンナ・ブラタスです。
手順を開始する前に、ドリルのステージロックをねじってドリルビットアダプタと無菌1ミリメートルドリルビットをドリルに挿入し、手動でビットロックを締めてドリルをロックします。ドリルを立体性フレームに取り付け、デジタルインジェクタの送達率を1分あたり0.4マイクロリットルに設定し、目標は2マイクロリットルです。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、麻酔マウスをフレーム上に置き、綿の先端アプリケーターの鈍い端を使用して、マウスバーのトラフに歯を配置します。
左耳の内側カンサスに対して左耳棒を押して頭蓋骨を安定させ、立体フレームのネジを使用して頭蓋骨を所定の位置にロックします。その後、同じ方法で右耳棒で頭蓋骨の反対側を固定します。カルバリアウィンドウを作るために、3つの連続交互ベタジン溶液と70%エタノールスクラブで頭皮をきれいにし、無菌メスを使用して、矢状縫合線に続く頭蓋骨の中央中央中央部の側面に沿って皮膚を通して3ミリメートルの切開を行います。
生殖不能ドリルビットを識別し、ブレグマに垂直に向け、デジタルバーニアスケールをゼロにリセットし、ドリルビットを矢状縫合糸に2ミリメートル横向きに、1ミリメートル前部を冠状縫合に移動させます。ドリルから皮膚を離れ、最高速度を使用してランドマークに注意を払い、約0.5ミリメートルの深さの穴をカルバリアを通して慎重に掘削し、必要に応じて滅菌生理液の滴でドリルサイトを冷却します。カルバリアウィンドウが作成されたら、ドリルを慎重に上げ、定位フレームからドリルを取り除きます。
がん細胞注射の場合は、自動インジェクターユニットを立体性装置に取り付け、DPBSで完全に再懸濁した6〜8マイクロリットルの細胞を無菌のハミルトン注射器にロードします。注射器を注入器に積み込み、少量の溶液を使い捨ての滅菌ドレープに分配して注射用の針をプライミングします。コットンチップアプリケーターを使用して70%エタノールで注射器を拭き、露出した大脳に触れるまで針の先端をカルバリアウィンドウの中央に合わせます。
デジタルバーニアスケールをゼロにリセットし、ゆっくりと脳に3ミリメートルの深さに針を挿入します。注射器の画面で実行を選択する前に、少なくとも60秒間脳内に針を残して、注射部位への細胞送達を開始します。すべての細胞が送達されたら、針を少なくとも3分間脳内で休ませて、脳のパレンチマが注射に慣れさせ、毎分0.75ミリメートルの速度で脳から針を引き込むことを可能にする。
腫瘍負担の磁気共鳴画像処理の場合、適当な実験時点での撮像の10〜20分前に、標準的な腹腔内注射によりマウスに対して20グラムの体重ガドリニウムベースの造影剤を100マイクロリットル当たり100マイクロリットル投与する。マウスの後注射を麻酔し、麻酔付きマウスを加熱ホルダーに置きます。ホルダーをマウスの脳表面コイルを装備した9.4 Tマグネットに入れ、ローカライザー画像を得ます。
次に、T2重み付けされた稀な配列を使用してマウス脳を画像化し、ガドリニウムベースのコントラストT1を重み付けした稀な配列をポストする。腫瘍の総容積を測定するには、ImageJで目的のMRIデータファイルを開き、自由手選択ツールを使用して腫瘍の周囲に輪郭を描きます。次に、[解析]タブを開き、メジャーを選択して、選択した領域の領域を取得します。
特定の時点で個々のマウスのスライスを含むすべての腫瘍が評価されたら、適切なデータ分析プログラムに値をエクスポートします。ここで、マウスマリンママ腫瘍細胞注射後7日目および10日目における単一マウスの腫瘍体積定量の代表的な概観が観察できる。スキャンごとに30枚のスライスを評価した結果、この分析では、7日目の注射後に5つのスライスが腫瘍負担を示すことが明らかになった。
10日目の間に、9つのスライスが腫瘍の負担を示した。各画像の腫瘍領域を実証通り測定し、腫瘍体積の変化を経て追跡することを可能にした。各細胞株と各レシピエントマウスモデルは一意であるため、イメージング精度を確保するために、注入される細胞数とMRIスケジュールの最適化が必要です。
この手順に従うと、脳は、単一細胞の単離または組織病理学的分析を含む、本質的に任意の下流アッセイのために収穫することができる。
