Этот внутричерепный протокол инъекций имеет важное значение, поскольку он позволяет точные инъекции, изо дня в день мониторинга, а также точное измерение объема опухоли для более эффективного изучения механизмов метастазирования мозга. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет осуществлять серийный мониторинг роста межкраниальной опухоли. Демонстрация процедуры будет Джонатан Spehar, выпускник научно-исследовательский сотрудник из лаборатории Sizemore, и Анна Bratasz, визуализации научный сотрудник из Университета штата Огайо малых животных Imaging Общий ресурс.
Перед началом процедуры, поворот этапе блокировки на дрель, чтобы сверло бит адаптер и стерильные один миллиметр сверла бит, чтобы быть вставлены в дрель и вручную затянуть бит замки, чтобы заблокировать дрель. Прикрепите дрель к стереотаксической раме и установите скорость доставки цифрового инжектора до 0,4 микролитров в минуту с целью двух микролитров. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, поместите анестезировал мышь на раму и использовать тупой конец хлопка наконечник аппликатора положение зубов в корыто рта бар.
Нажмите левую планку уха против медиальной кантус левого уха, чтобы стабилизировать череп и использовать винт на стереотаксической раме, чтобы заблокировать череп на место. Затем закретить другую сторону черепа с правой ухо бар таким же образом. Чтобы сделать кальвариальное окно, очистить кожу головы с тремя последовательными чередующихся бетадин раствор и 70%этанол скрабы и использовать стерильный скальпель, чтобы сделать три миллиметра разрез через кожу вдоль центрального медианного аспекта черепа после sagittal линии шва.
Определите и сориентировать стерильную дрель немного перпендикулярно брегме, убедившись, что сбросить цифровую шкалу vernier к нулю и переместить сверло бит два миллиметра боковой к sagittal шва и один миллиметр передней к корональной шва. Перемещение кожи от сверла и с использованием самой высокой скорости и обращая внимание на ориентиры, тщательно просверлить отверстие, примерно 0,5 миллиметра глубиной, через кальварию, охлаждение места бурения с каплями стерильного солевого раствора по мере необходимости. После того, как кальгоральное окно было сделано, осторожно поднимите дрель и удалите дрель из стереотаксической рамы.
Для инъекций раковых клеток прикрепите автоматический инжектор к стереотаксическому аппарату и загрузите шесть-восемь микролитров клеток, тщательно повторно использованных в DPBS, в стерильный шприц Гамильтона. Загрузите шприц на инжектор и выделите небольшой объем раствора на одноразовую стерильную драпировку, чтобы подумить иглу для инъекций. Используйте хлопчатобумажный наконечник аппликатора, чтобы протереть шприц с 70% этанола и выровнять кончик иглы к центру кальвариального окна, пока он почти не коснется открытого головного мозга.
Сбросьте цифровую шкалу vernier к нулю и медленно вставьте иглу в глубину в три миллиметра в мозг. Оставьте иглу в головном мозге, по крайней мере 60 секунд, прежде чем выбрать запустить на экране инжектора, чтобы начать доставку клетки к месту инъекции. Когда все клетки были доставлены, позволяют иглы отдохнуть в мозге, по крайней мере три минуты, чтобы мозг parenchyma акклиматизироваться к инъекции, прежде чем втягивать иглу из мозга со скоростью 0,75 миллиметра в минуту.
Для магнитно-резонансной томографии опухолевого бремени, за 10-20 минут до визуализации в соответствующей экспериментальной точке времени, вводят 100 микролитров на 20 граммов гадолиния на основе массы тела контрастных агентов мыши стандартной внутриперитонеальной инъекции. Обезболить мышь после инъекции и поместить анестезированной мыши на подогревом держатель. Поместите держатель в магнит 9.4 T, оснащенный катушкой поверхности мозга мыши и получите изображение локализатора.
Затем изображение мозга мыши с помощью T2 взвешенных редкой последовательности и после гадолиния основе контраста T1 взвешенных редкой последовательности. Чтобы измерить общий объем опухоли, откройте файл данных МРТ, представляющий интерес в ImageJ, и используйте инструмент свободного выбора руки, чтобы нарисовать контур вокруг опухоли. Затем откройте вкладку анализа и выберите меру для получения области выбранного региона.
Когда все опухоли, содержащие ломтики для отдельной мыши в этот конкретный момент времени были оценены, экспортировать значения в соответствующую программу анализа данных. Здесь, репрезентативный обзор объема опухоли количественной оценки для одной мыши в день 7 и день 10 пост мурин молочной опухолевой клетки инъекции можно наблюдать. Оценка 30 ломтиков на сканирование показала, что для этого анализа, в день семь после инъекций, пять ломтиков выставлены опухоли бремя.
В то время как в день 10, девять ломтиков выставлены опухоли бремя. Область опухоли на каждом изображении затем измеряется, как попродемонстрировано, что позволяет отслеживать изменение объема опухоли с течением времени. Каждая линия клеток и модель мыши-получателя уникальны и поэтому требуют оптимизации количества введенных клеток и графика МРТ для обеспечения точности визуализации.
После этой процедуры, мозг может быть собран для практически любого вниз по течению анализа, в том числе одноклеточной изоляции или гистопатологического анализа.
