このプロトコルは、海洋遠洋チュニックな小子pleuraジオカのための長期的で信頼性の高い文化システムを確立する方法を視覚的に示しています。エコプレウラ文化システムは、生態学、開発、ゲノミクス、進化に関する幅広い生物分野を調査するための基礎資源を提供します。この種は短いライフサイクル、高い胎児性を有し、それは容易に海岸から収集することができ、それは優れたモデル生物を作る。
このプロトコルはO.dioica用に最適化されていますが、他のプランクトニック生物にも応用できることを願っています。まず、ろ過された海水をオートクレーブから始めて、オイコプレウラ文化を維持するために藻類の食べ物を開始します。チェートセロカルシトランスのストック培養を開始するために、60ミルのオートクレーブ海水に次の30マイクロリットルのビタミン、30マイクロリットルの溶液A、15マイクロリットルの珪酸ナトリウム、および60マイクロリットルのストレプトマイシンが補充された。
最後に、以前のストック培養物から30マイクロリットルのC.calcitransを接種剤として添加した。他の藻類種および培養物のサプリメントおよび接種量に関する原稿の表2を参照してください。接種後、在庫とサブカルチャーは、連続照明で摂氏17度のインキュベーターに維持されます。
約10日後、フラスコが着色することで藻類の成長が確認される。この場合、同じ培養器でサブカルチャーを維持しながら、ストックカルチャーを摂氏4度で最長1ヶ月間長期保存に移します。作業文化を作成するには、オートクレーブ海水の400ミルに必要なサプリメントを追加し、前のサブカルチャーの100ミルで接種します。
ゴム製のキャップでフラスコを密封し、1ミルの使い捨てピペットを挿入し、藻場に移し、8時間の日光周期と一定の気密で室温で維持します。フラスコの底部に凝集を防ぐために、1日2回手動で藻類培養を回す。藻類の培養が確立されたら、現地のサイトでフィールドサンプルを収集します。
プランクトンネットをキャストし、タラの端が水面下1〜2メートル沈むことを許可します。毎秒約5〜1メートルの速度でネットを牽引します。2分から5分の間、引き続き前後に引き続き行き来します。
牽引時間は、敷地内のプランクトンの豊富さに応じて調整する必要があります。牽引した後、慎重にネットを持ち上げ、タラの端の内容物を500ミルのガラス瓶にゆっくりと移します。輸送中に動物にストレスを引き起こす可能性のある気泡を避けるために、リムにボトルを充填します。
この段階では、試料ボトルを暗い背景に見ることで、オイコプレラの存在を確認することができます。しかし、種レベルの同定には顕微鏡観察が必要である。500ミルボトル3本が回収されるまで、このプロセスを繰り返します。
水面海水を収集して、CTDプロファイラで塩分濃度、温度、クロロフィル濃度を記録します。さらに、現場の海水を10~15リットル集めて、動物を実験室の状態に順応させます。動物を順応させるために、サンプルサイトから水面海水の1対1の比率を調製し、実験室で維持されたろ過海水を調製します。
最終的な容積はプランクトンサンプルの集中によって5から10リットルの間に調節されるべきである。準備したビーカーに慎重に500ミルサンプルを追加します。15 RPMで回転する同期モータに取り付けられたパドルを使用して、プランクトンを一晩サスペンションに保管してください。
翌朝、目でオイコプレラの存在を確認してください。動物をペトリ皿に移し、正の識別のために倍率20〜40倍に設定された暗視野顕微鏡の下で観察する。オイコプレウラは、半透明の家の中で尾を起伏させるオタマジャクシ型の動物として特徴付けられる。
O.dioicaを確認するには、黄色の生殖腺を持つ完全に成熟した男性や卵を持つメスを探してください。動物が未熟な場合は、尾の遠位半分に2つの脊索下細胞の存在を探します。これらは成熟した動物と未熟な動物の両方に存在する。
種が確認されたら、新しいペトリ皿に移します。種レベルで10〜20個体が確認されるまで、このプロセスを繰り返します。O.dioicaが見つからない場合は、ビーカーを1日か2日かき混ぜておいてください。
最初は観察できなかった小さなO.dioicaは成長し続け、見やすくなります。1 週間後に何も表示されない場合は、サンプルを破棄して、もう一度サンプリングを試みます。単一培養を確立するために、5リットルのろ過海水中のフィールドサンプルから120 O.dioicaを分離します。
翌朝、黄色い生殖腺によって識別される完全に成熟した男性と、きらめく黄金の球体として現れる卵を持つメスを探します。5milの鈍いピペットを持つ15人の男性と30人のメスを、2.5リットルのろ過された海水を含むビーカーにそっと移すことによって、産卵ビーカーを準備します。手動移動中の物理的なストレスを最小限に抑えるために、新しい海水の表面の下で動物をゆっくりと放出する。
孤立した大人が自然に産卵することを可能にする。産卵後、産卵ビーカーの底から5~10milの海水を抽出し、顕微鏡下で切断した卵子を同定することで、成功した受精を確認できる。産卵後の最初の朝、1日目には、膨らんだ家を持つ新世代の若い動物がビーカーに現れるはずです。
500マイルのハンドヘルドビーカーを使用して、7.5リットルの新鮮なろ過された海水を含む新しいビーカーに動物を優しく移します。乱流とせん断力を最小限に抑えるために、表面の内容をゆっくりと注ぎます。産卵後の2日目の2日目の朝、150匹の動物を5リットルの新鮮なろ過海水を含む新しいビーカーに手動で移します。
3日目の3日目の3日目には、120匹の動物を5リットルの新鮮なろ過された海水を持つ新しいビーカーに手動で移します。4日目までに、性的に成熟した、成虫の動物が存在するべきである。2.5リットルのろ過海水を含む新しい産卵ビーカーのために15人の男性と30人の女性を集めて、次世代を開始します。
このプロセスは、文化の寿命のために繰り返され、維持されます。O.dioicaの単一培養を維持するために、アルガルフードは働く文化から毎日用意されています。動物は1日に3回餌を与えられる。
660ナノメートルに設定された分光光度計を用いて、作業文化の吸光度を測定して、毎日の食品を準備します。吸光度値、目標O.dioica培養量、および動物成熟度は、以前に決定された藻類の成長曲線に基づいて準備されたスプレッドシートに配置され、その日の給餌に必要な藻類の正確な体積を計算する。計算された体積を50ミルチューブにピペットし、遠心分離機を室温で5分間5分間遠心分離します。
ゆっくりと上清を注ぎ、慎重にピペットを上下にしてペレット藻類を再中断します。新鮮な、ろ過された海水で元のボリュームにチューブを補充します。スプレッドシートから毎日の藻類の供給チャートに基づいて、9 a.mで各ビーカーに指定された量を供給します。
12 p.mおよび5 p.m。自動ドージングポンプは、5 p.mで動物に供給するように設定することができます。
週末には、培養スタッフの存在なしに。各給餌後、次の飼料に使用する準備ができるまで、調製した藻類食品を摂氏4度に維持します。O.dioicaは100ミクロンのメッシュと非濾過タラの端を取り付けた修正されたプランクトンネットの穏やかな牽引によって港から集めることができる。
2015年から19年の間のサンプリングは、沖縄の港でのO.dioicaの存在に季節変動を示した。水面海水の温度は動物の存在に影響を与えているように見えた。水面水温が28度以上のときに支配的なO.dioica。
O.dioicaは24度から27度の温度でオイコプレウラロンギカウダと共存しました。しかし、O.ロンディカウダは23度以下の気温で支配しました。多量の変化はO.dioicaの豊富さとは一つの相関しなかった。
安定したO.dioica培養システムを確立するための3つの最も重要な要因は、多段階ろ過システムで高い水質を維持し、理想的な供給体制を特定し、好ましくは藻類標準曲線を作成し、十分な数の男性と女性でビーカーを産卵する準備です。提供されたプロトコルに従って、O.dioicaのライフサイクルは23度で4日間です。私たちは、O.dioicaの6つの独立した集団を確実に確立し、そのすべてが20世代以上続きました。
結論として、O.dioicaの安定した文化を確立することは、迅速かつ費用対効果の高い方法で行うことができます。適切なセットアップにより、1週間以内に安定した文化を実現できます。小さなゲノムと迅速なライフサイクルと組み合わせることで、O.dioicaは強力なチョルデートモデル種になります。
O.dioicaは人工海水と天然海水の両方で維持することができます。藻類食品の長期保存は、固体培養および凍結保存を使用して可能である。さらに、O.dioica精子も凍結保存され、1年以上生存可能であり続けることができます。
O.dioicaは、様々な生物分野に関する強力な洞察を提供し続けています。地域の季節性、細心の文化システム、そして少数の献身的な個人を理解することで、効果的な文化をほとんど努力して確立することができます。
