هذا البروتوكول يوضح بصريا كيفية إنشاء طويلة الأجل، ونظام ثقافة موثوق بها للثنية البحرية أويكولبورا ديويكا. يوفر نظام ثقافة Oikopleura الموارد الأساسية لدراسة مجموعة واسعة من المجالات البيولوجية المتعلقة بالبيئة والتنمية وعلم الجينوم والتطور. هذا النوع لديه دورة حياة قصيرة، وبراز عالية، ويمكن جمعها بسهولة من الشاطئ، مما يجعلها كائن حي نموذج ممتاز.
على الرغم من أن هذا البروتوكول هو الأمثل ل O.dioica، ونحن نأمل أن يمكن تطبيقه على الكائنات الحية planktonic أخرى. للبدء، بدء الغذاء الطحالب للحفاظ على ثقافة Oikopleura، بدءا من autoclaving مياه البحر المصفاة. لبدء ثقافة الأسهم من Chaetoceros calcitrans ، تم استكمال 60 مل من مياه البحر ذات التكفا مع ما يلي : 30 ميكرولتر من الفيتامينات ، 30 ميكرولترات من الحل A ، 15 ميكرولترات من سيليكات الصوديوم ، و 60 ميكرولتر من الستريبتومايسين.
وأخيرا، تمت إضافة 30 ميكرولترات من C.calcitrans من ثقافة الأسهم السابقة باعتبارها تلقيح. راجع الجدول الثاني في المخطوطة المتعلق بمجلات المكملات واللقح للأنواع الطحالب الأخرى وأنواع الاستزراع. بعد التطعيم ، يتم الحفاظ على الأسهم والثقافات الفرعية في حاضنة عند 17 درجة مئوية مع إضاءة مستمرة.
بعد ما يقرب من 10 يوما، يتم تأكيد نمو الطحالب من قبل القارورة تصبح ملونة. عندما يحدث ذلك، نقل الثقافات الأسهم إلى التخزين على المدى الطويل في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد مع الحفاظ على ثقافة فرعية في الحاضنة نفسها. لخلق ثقافة العمل، إضافة المكملات الغذائية اللازمة إلى 400 مل من مياه البحر أوتكاوندفيد وتلقين مع 100 مل من الثقافة الفرعية السابقة.
ختم القارورة مع غطاء مطاطي، وإدراج ماصة واحدة mil، المتاح، ونقلها إلى محطة الطحالب والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة مع photoperiod لمدة ثماني ساعات والتهيّم المستمر. دوّامة الطحالب يدوياً مرتين في اليوم لمنع التجميع في الجزء السفلي من القارورة. وبمجرد تأسيس الثقافات الطحالب، قم بجمع عينات ميدانية في موقع محلي.
يلقي شبكة من الدول، والسماح لنهاية سمك القد لإغراق متر إلى مترين تحت السطح. سحب الشبكة بسرعة حوالي 5 إلى متر واحد في الثانية. استمر في السحب ذهاباً وإياباً لمدة تتراوح بين دقيقتين وخمس دقائق.
وينبغي تعديل وقت القطر وفقا لوفرة الدول في الموقع. بعد السحب، ورفع بعناية خارج الشبكة ونقل ببطء محتويات نهاية سمك القد إلى 500 ميل، زجاجة. ملء زجاجة إلى حافة لتجنب فقاعات الهواء التي يمكن أن تسبب الإجهاد للحيوانات أثناء النقل.
في هذه المرحلة، يمكن تأكيد وجود أوكوبلورا عن طريق عرض زجاجات العينة على خلفية داكنة. ومع ذلك، فإن المراقبة المجهرية مطلوبة لتحديد مستوى الأنواع. كرر هذه العملية حتى تم جمع ثلاث زجاجات 500 ميل.
جمع مياه البحر السطحية لتسجيل الملوحة ودرجة الحرارة وتركيز الكلوروفير مع محلل CTD. بالإضافة إلى ذلك، جمع 10 إلى 15 لترا من مياه البحر في الموقع للمساعدة في التأقلم الحيوانات لظروف المختبر. ولتكميم الحيوانات، قم بإعداد نسبة مياه البحر السطحية من موقع العينة إلى واحد، ومياه البحر التي تمت تصفيتها في المختبر.
يجب تعديل الحجم النهائي إلى ما بين خمسة إلى 10 لترات ، اعتمادًا على تركيز عينة الألواح. قم بإضافة عينة 500 ميل بعناية إلى القارض المعد. باستخدام مجداف تعلق على محرك متزامن الدورية في 15 دورة في الدقيقة، والحفاظ على الدول المعلقة في الليل.
في صباح اليوم التالي، تحقق من وجود أوكوبلو مورا بالعين. نقل الحيوانات إلى طبق بيتري، ومراقبة تحت مجهر حقل الظلام تعيين إلى ما بين التكبير 20 إلى 40 مرة لتحديد إيجابية. تتميز Oikopleura بأنها على شكل شرغوف متموجة في ذيولها داخل منزل شفاف.
لتأكيد O.dioica، ابحث عن الذكور ناضجة تماما مع السناد الأصفر أو الإناث مع البيض. إذا كانت الحيوانات غير ناضجة ، ابحث عن وجود خليتين دون كل منهما في نصف الذيل. هذه موجودة في كل من الحيوانات الناضجة وغير الناضجة.
بمجرد تأكيد الأنواع ، قم بنقلها إلى طبق بيتري جديد. كرر هذه العملية حتى تم تأكيد 10 إلى 20 فردًا على مستوى الأنواع. إذا لم يتم العثور على O.dioica، والحفاظ على الإثارة منقار ليوم أو يومين.
سوف O.dioica الصغيرة التي لم تكن في البداية يمكن ملاحظتها تستمر في النمو وتصبح أسهل في الرؤية. إذا لم يظهر أي منها بعد أسبوع واحد، فتجاهل العينة وحاول أخذ العينات مرة أخرى. من أجل إنشاء زراعة أحادية، عزل 120 O.dioica من عينة حقل في خمسة لترات من مياه البحر المصفاة.
في صباح اليوم التالي، ابحث عن الذكور الناضجين تمامًا الذين تم تحديدهم بواسطة السناد الأصفر وللإناث مع البيض الذي يظهر على أنه متلألئ، والمجالات الذهبية. إعداد منقار التفريخ عن طريق نقل بلطف 15 من الذكور و 30 أنثى مع خمسة مل، حادة الهادصة إلى منقار يحتوي على 2.5 لتر من مياه البحر المصفاة. لتقليل الضغط الجسدي أثناء النقل اليدوي، قم بإطلاق سراح الحيوانات ببطء تحت سطح مياه البحر الجديدة.
السماح للبالغين المعزولين بالتفريخ بشكل طبيعي. بعد التفريخ، يمكن تأكيد الإخصاب الناجح عن طريق استخراج خمسة إلى 10 مل من مياه البحر من قاع منقار التفريخ وتحديد البيض مع انشقاقات تحت المجهر. في صباح اليوم الأول بعد التفريخ، اليوم الأول، يجب أن يظهر جيل جديد من الحيوانات الصغيرة ذات المنازل المضخمة في القارق.
استخدمي منقار محمولاً بـ500 ميل لنقل الحيوانات بلطف إلى منبر جديد يحتوي على 7.5 لتر من مياه البحر العذبة المصفاة. صب المحتوى ببطء على السطح لتقليل الاضطرابات وقوا القص. في اليوم الثاني بعد التفريخ، اليوم الثاني، نقل 150 حيوانا يدويا إلى قارب جديد يحتوي على خمسة لترات من مياه البحر العذبة المصفاة.
في الصباح الثالث بعد التفريخ، اليوم الثالث، نقل يدويا 120 حيوانا إلى بقار جديد مع خمسة لترات من مياه البحر الطازجة، المصفاة. بحلول اليوم الرابع ، ناضجة جنسيا ، وينبغي أن تكون الحيوانات البالغة موجودة. جمع 15 من الذكور و 30 أنثى لقارح تفريخ جديد مع 2.5 لتر من مياه البحر المصفاة لبدء الجيل القادم.
يتم تكرار هذه العملية والحفاظ عليها لحياة الثقافة. من أجل الحفاظ على ثقافة أحادية من O.dioica، يتم إعداد الطعام الطحالب يوميا من الثقافات العاملة. يتم إطعام الحيوانات ثلاث مرات في اليوم.
إعداد الغذاء اليومي عن طريق قياس امتصاص ثقافة العمل باستخدام مقياس الطيفي تعيين في 660 نانومتر. يتم وضع قيم الامتصاص ، وحدات التخزين المستهدفة في O.dioica culture ، ونضج الحيوان في جدول بيانات معد بناءً على منحنى نمو الطحالب المحدد مسبقًا لحساب الحجم الدقيق للطحالب المطلوبة لتغذية اليوم. Pipette وحدات التخزين المحسوبة في أنابيب 50 مليون، والطرد المركزي في 5، 000g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
صب ببطء قبالة مُتطّر، وماصة بعناية صعودا وهبوطاً لإعادة تعليق الطحالب الوُكية. إعادة ملء الأنابيب إلى حجمها الأصلي مع مياه البحر الطازجة، وتصفية. استنادًا إلى مخطط التغذية الطحالبي اليومي من جدول البيانات، قم بتغذية المبلغ المحدد لكل من القارق في الساعة 9 .m.
12 ص.m و5 .m. يمكن تعيين مضخة الزُنَة الآليّة لإطعام الحيوانات في 5 .m.
في عطلة نهاية الأسبوع دون وجود الموظفين زراعة. بعد كل تغذية، والحفاظ على الغذاء الطحالب المعدة في أربع درجات مئوية حتى جاهزة لاستخدامها في الأعلاف المقبل. O.dioica يمكن جمعها من ميناء عن طريق سحب لطيف من صافي العوالق المعدلة مزودة شبكة 100 ميكرون ونهاية سمك القد غير مرشح.
أظهرت العينات بين عامي 2015 و 19 اختلافًا موسميًا في وجود O.dioica في موانئ أوكيناوا. ويبدو أن درجة حرارة مياه البحر السطحية تؤثر على وجود الحيوانات. سيطر O.dioica عندما كانت درجة حرارة مياه البحر السطحية 28 درجة أو أعلى.
تعايشت O.dioica مع Oikopleura longicauda في درجات حرارة تتراوح بين 24 إلى 27 درجة. ومع ذلك، هيمنت أو لونغيكاودا في درجات حرارة أقل من 23 درجة. ولم ترتبط التغيرات في الملوحة بوفرة أو دييكا.
أهم ثلاثة عوامل لإنشاء أنظمة ثقافة O.dioica مستقرة هي الحفاظ على جودة المياه العالية مع نظام ترشيح متعدد الخطوات ، وتحديد نظام التغذية الأمثل ، ويفضل عن طريق إنشاء منحنيات قياسية الطحالب ، وإعداد مناقور التفريخ مع أعداد كافية من الذكور والإناث. بعد البروتوكول المقدمة، دورة حياة O.dioica أربعة أيام في 23 درجة. لقد أنشأنا بشكل موثوق ستة سكان مستقلين من أودييكا، والتي استمرت جميعها أكثر من 20 جيلا.
في الختام، يمكن إنشاء ثقافة مستقرة من O.dioica يتم بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. مع الإعداد المناسب، يمكن تحقيق ثقافة مستقرة في غضون أسبوع واحد. بالتزامن مع الجينوم الصغير و دورة الحياة السريعة ، وهذا يجعل O.dioica أنواع نموذج قوي.
يمكن الحفاظ على O.dioica في كل من مياه البحر الاصطناعية والطبيعية. التخزين على المدى الطويل من المواد الغذائية الطحالب ممكن باستخدام ثقافة صلبة و التبريد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضًا أن يتم تقديم الحيوانات المنوية من O.dioica في حالة اِلَتَمْدٍ والبقاء صالحة لأكثر من عام.
O.dioica تواصل تقديم رؤى قوية في مختلف المجالات البيولوجية. إن فهم الموسمية المحلية، ونظام الثقافة الدقيق، وعدد قليل من الأفراد المتفانين يسمح بنشأة ثقافة فعالة مع القليل من الجهد.
