Этот протокол наглядно демонстрирует, как создать долгосрочную, надежную культурную систему для морской пелагической туники Oikopleura dioica. Система культуры Oikopleura предоставляет базовые ресурсы для изучения широкого спектра биологических областей, связанных с экологией, развитием, геномикой и эволюцией. Этот вид имеет короткий жизненный цикл, высокую плодовитость, и его можно легко собрать с берега, что делает его отличным моделью организма.
Хотя этот протокол оптимизирован для O.dioica, мы надеемся, что он может быть применен к другим планктонным организмам. Для начала, инициировать водорослей пищи для поддержания культуры Oikopleura, начиная с автоклавирования фильтрованной морской воды. Для инициирования биржевой культуры Chaetoceros calcitrans, 60 миль автоклавной морской воды было дополнено следующими:30 микролитров витаминов, 30 микролитров раствора А, 15 микролитров силиката натрия и 60 микролитров стрептомицина.
Наконец, 30 микролитров C.calcitrans из предыдущей фондовой культуры был добавлен в качестве инокуланта. Обратитесь к таблице 2 в рукописи относительно объемов дополнения и прививки для других видов водорослей и видов культуры. После прививки запасы и субкультуры поддерживаются в инкубаторе при 17 градусах Цельсия с непрерывным освещением.
Примерно через 10 дней рост водорослей подтверждается тем, что колбы становятся цветными. Когда это произойдет, переместить фондовых культур в долгосрочное хранение на четыре градуса по Цельсию на срок до одного месяца при сохранении субкультуры в том же инкубаторе. Чтобы создать рабочую культуру, добавьте необходимые добавки к 400 милам автоматической морской воды и прививки с 100 милами предыдущей субкультуры.
Запечатайте колбу резиновой крышкой, вставьте одноразовый пипетку на один мил и переместите их на станцию водорослей и поддерживайте их при комнатной температуре с помощью восьмичасового фотопериода и постоянной аэрации. Вручную вихревой водорослей культур два раза в день, чтобы предотвратить агрегацию в нижней части колбы. После того, как водоросли культуры были созданы, собирать образцы поля на местном сайте.
Бросьте планктонную сетку и позвольте концу трески опуститься на один-два метра ниже поверхности. Буксировать сеть со скоростью от 5 до 1 метра в секунду. Продолжайте буксировку туда и обратно в течение двух-пяти минут.
Время буксировки должно быть скорректировано в соответствии с изобилием планктона на месте. После буксировки осторожно вынравлите сетку и медленно перенесите содержимое трески в 500-мильную стеклянную бутылку. Заполните бутылку на ободе, чтобы избежать пузырьков воздуха, которые могут вызвать стресс для животных во время транспортировки.
На этом этапе наличие Oikopleura может быть подтверждено просмотром образцов бутылок на темном фоне. Однако для идентификации видов требуется микроскопическое наблюдение. Повторите этот процесс до тех пор, пока не будут собраны три бутылки на 500 миль.
Соберите поверхностную морскую воду для записи солености, температуры и концентрации хлорофилла с помощью профилера CTD. Кроме того, соберите от 10 до 15 литров морской воды на месте, чтобы помочь акклиматизировать животных к лабораторным условиям. Чтобы акклиматизировать животных, подготовьтесь к соотношению поверхностной морской воды с места образца и фильтрованной морской воды, которая поддерживается в лаборатории.
Окончательный объем должен быть скорректирован до 5-10 литров, в зависимости от концентрации образца планктона. Аккуратно добавьте 500-мильный образец в подготовленный стакан. Используя весло, прикрепленное к синхронному двигательу, вращающееся при 15 об/мин, держите планктон в подвеске на ночь.
На следующее утро проверьте наличие Oikopleura на глаз. Перенесите животных в чашку Петри и наблюдайте под темным полем микроскопа, установленного между увеличением от 20 до 40 раз для положительной идентификации. Oikopleura характеризуются как головастик формы животных волнистые хвосты внутри полупрозрачного дома.
Чтобы подтвердить O.dioica, ищите полностью зрелых самцов с желтыми гонадами или самок с яйцами. Если животные незрелые, ищите наличие двух субхордальных клеток в дистальной половине хвоста. Они присутствуют как у зрелых, так и у незрелых животных.
Как только вид подтвердится, перенесите их в новое блюдо Петри. Повторите этот процесс до тех пор, пока от 10 до 20 особей не будут подтверждены на уровне видов. Если O.dioica не найдены, держите стакан перемешивания в течение дополнительного дня или двух.
Малый O.dioica, которые изначально не наблюдались будет продолжать расти и становится легче увидеть. Если ни один не появится через неделю, отбросьте образец и повторите попытку отбора проб. Для создания монокультуры изолируйте 120 O.dioica из полевого образца в пяти литрах фильтрованной морской воды.
На следующее утро ищите полностью зрелых самцов, идентифицированных желтыми гонадами, и самок с яйцами, которые выглядят как мерцающие, золотые сферы. Подготовь нерестовую стакан, аккуратно переведя 15 самцов и 30 самок с пятимильную тупую пипетку в стакан, содержащий 2,5 литра фильтрованной морской воды. Чтобы свести к минимуму физическую нагрузку во время ручной передачи, медленно отпустите животных под поверхность новой морской воды.
Разрешить изолированных взрослых нереста естественно. После нереста, успешное оплодотворение может быть подтверждено путем извлечения от пяти до 10 миль морской воды со дна нереста стакана и выявления яиц с расщеплениями под микроскопом. В первое утро после нереста, в первый день, в стакане должно появиться новое поколение молодых животных с надутыми домами.
Используйте 500-мильный портативный стакан, чтобы аккуратно перенести животных в новый стакан, содержащий 7,5 литров свежей, фильтрованной морской воды. Медленно вылейте содержимое на поверхность, чтобы свести к минимуму турбулентность и силы стрижки. На второе утро после нереста, второй день, вручную перенесите 150 животных в новый стакан, содержащий пять литров свежей, фильтрованной морской воды.
На третье утро после нереста, третий день, вручную перенесите 120 животных в новый стакан с пятью литрами свежей, фильтрованной морской воды. К четвертому дню, сексуально зрелые, взрослые животные должны присутствовать. Соберите 15 самцов и 30 самок для нового нерестового стакана с 2,5 литрами фильтрованной морской воды, чтобы инициировать следующее поколение.
Этот процесс повторяется и поддерживается для жизни культуры. Для поддержания монокультуры O.dioica, водоросли пища готовится ежедневно из рабочих культур. На животных кормят три раза в день.
Подготовка ежедневной пищи путем измерения абсорбтности рабочей культуры с помощью спектрофотометра, установленная на уровне 660 нанометров. Значения абсорбанса, целевые объемы культуры O.dioica и зрелость животных помещаются в подготовленную таблицу на основе ранее определяемой кривой роста водорослей для расчета точного объема водорослей, необходимых для кормления в течение дня. Pipette рассчитывается объемов в 50-мильных труб, и центрифуга на 5000г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Медленно слить супернатант, и тщательно пипетки вверх и вниз, чтобы повторно гранулы водорослей. Пополнить трубки до их первоначального объема со свежей, фильтрованной морской водой. Основываясь на ежедневной диаграмме кормления водорослей из электронной таблицы, кормите указанное количество каждому стакану в 9 .m.
12 .m и 17.m. Автоматизированный досинг насос может быть установлен, чтобы кормить животных в 5 .m.
по выходным без присутствия культового персонала. После каждого кормления, поддерживать подготовленную пищу водорослей на четыре градуса по Цельсию до готовности к использованию для следующего корма. O.dioica может быть собрана из гавани нежным буксировкой модифицированной планктонной сетки, оснащенной 100-микрон-сеткой и нефильтровавным концом трески.
Выборка в период с 2015 по 19 год показала сезонные колебания в присутствии O.dioica в гаванях Окинавы. Температура поверхностных морских вод, казалось, влияет на присутствие животных. O.dioica доминировала, когда температура поверхностной морской воды была 28 градусов или выше.
O.dioica сосуществовала с Oikopleura longicauda при температуре от 24 до 27 градусов. Тем не менее, O.longicauda доминировали при температурах ниже 23 градусов. Изменения солености не коррелировали с обилием O.dioica.
Тремя наиболее важными факторами для создания стабильных систем культуры O.dioica являются поддержание высокого качества воды с помощью многоступенчатой системы фильтрации, определение оптимального режима кормления, предпочтительно путем создания водорослей стандартных кривых, и подготовка нереста стаканов с достаточным количеством мужчин и женщин. В соответствии с предоставленным протоколом жизненный цикл O.dioica составляет четыре дня при 23 градусах. Мы надежно создали шесть независимых популяций O.dioica, все из которых длились более 20 поколений.
В заключение, создание стабильной культуры O.dioica может быть сделано быстро и экономически эффективно. При надлежащей настройке, стабильная культура может быть достигнута в течение одной недели. В сочетании с небольшим геномом и быстрым жизненным циклом, это делает O.dioica мощным chordate моделью видов.
O.dioica может поддерживаться как в искусственной, так и в естественной морской воде. Долгосрочное хранение водорослей возможно с использованием твердой культуры и криоконсервации. Кроме того, сперма O.dioica также может быть криоконсервирована и оставаться жизнеспособной в течение более года.
O.dioica продолжает предоставлять мощные идеи в различных биологических областях. Понимание местной сезонности, тщательная система культуры и несколько преданных своему делу людей позволяют установить эффективную культуру без особых усилий.
