このプロトコルは、大腸菌における遺伝回路の継続的な測定と、個々の細菌細胞における信号変動性および信号対雑音比の計算における回路性能を評価する。この技術の主な利点は、異なる株やラボに簡単に適応可能であり、最小限のトレーニングと特別な機器を必要とし、比較的安価であるということです。ノイズは、生物学的システムの機能を決定する上で重要な役割を果たします。
現在、大規模な遺伝子回路の構築に関心があります。これらのシステムは、ノイズによって阻害することができますサンプルをよく乾燥させ、そのチルパッドをできるだけ長く摂氏4度に保ち、部品を辛抱強く穏やかに切断して分割してください。分析のために細菌を調製するために、トランスフェクトされた大腸菌培養物から単一コロニーを接種する。
たとえば、GFP レポーターを含む回線です。LBスープの5ミリリットルを含むガラス管では、関連する抗生物質でそれを補う。スープが曇るまで2時間、揺れインキュベーターで摂氏37度と毎分250回転で細胞を成長させます。
インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのミニマイクロ遠心分離機で1ミリリットルの希釈液をスピンダウンし、30マイクロリットルの細菌と希釈液の全容を新しい2ミリリットルチューブに移します。次に、この懸濁液の40~60マイクロリットルをM9培養プレートに播種する前に、振盪して1時間培養します。分析のために細菌を調製するために、トランスフェクトされた大腸菌培養物から単一コロニーを接種する。
例えば、関連する抗生物質を補ったLBスープの5ミリリットルを含むガラス管のGFPレポーターを有する回路。スープが曇るまで2時間、揺れインキュベーターで摂氏37度と毎分250回転で細胞を成長させます。インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのミニマイクロ遠心チューブで希釈液を1ミリリットル回転させ、30マイクロリットルの細菌と希釈液の全容を新しい2ミリリットルチューブに移します。
その後、シェイクで1時間培養します。顕微鏡プレートを準備するには、低融解寒天の112.5ミリグラムと40ミリグラムの寒天、25ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに2%カザミノ酸1ミリリットルを混ぜます。次に、25ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコの内側の唇に8.92ミリリットルの最小限の培地を加え、得られた溶液を短く、2〜3秒のバーストでマイクロ波します。
その後、水浴を摂氏55度に設定します。溶液がはっきりしたら、摂氏60度の水浴に25ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコを置き、寒天溶液が温度が摂氏約45〜50度に下がるまで冷却します。寒天冷却中、70%エタノールでラボベンチを清掃し、クリーニングされたベンチにラボテープを滑らかにします。
1つのガラスカバースリップをテープの上に置き、2番目のカバースリップを近くに置きます。適切な抗生物質と溶液に冷却寒天溶液を追加します。テープの上に置かれたカバースリップに溶液をゲル化するために準備したての1.5ミリリットルを注ぎ、泡を避けるように注意して、2番目のカバースリップをゲルに置きます。
エルレンマイヤーを温水浴場に戻し、カバースリップを20分間覆います。カバースリップを摂氏4度で1時間のインキュベーションで反転します。インキュベーションの終わりに、ドライゲルからカバースリップを取り出し、アガロースから小さなパッドを切ります。
インキュベーション中に、調製した細菌懸濁液の6マイクロリットルの液滴を35ミリメートル皿に加え、滴を少なくとも15〜30分間乾燥させます。その後、慎重に細菌の1滴に一度にパッドを置き、サンプルが室温で20分間設定できるようにします。サンプルを塗らずに寒天ベッドを置くために、慎重に穏やかなタッピングで液滴の上にクールパッドを配置します。
サンプルを画像化するには、フラスコを水から取り出し、ゲル溶液を体温まで冷却させます。サンプルプレートの周囲にゲルの3ミリメートルを注ぎます。アガロースが固まったら、テープでプレートを密封し、25ゲージの針を使用してテープにいくつかの穴を開けます。
その後、細胞の有糸分裂を防ぎながら、アガロースが完全に固化できるように、プレートを摂氏4度で少なくとも30分間逆さまに置きます。24時間以内に、蛍光共焦点顕微鏡を使用して、最も低い倍率でサンプルを見つけ、顕微鏡の自動焦点システムに従事します。適切な目的にオイルを塗布し、慎重に油を広げるためにプレートを移動するためにプラットフォームコントローラを使用しています。
次に、自動フォーカスを再び設定し、Z ステップの断面のデフォルトの提案に従ってサンプルをイメージします。大腸菌は、オフの白い背景に黒い楕円形として表示されるはずです。そして、輝度のダイナミックレンジは、その中心にスパイクを示す必要があります。
三味のイベントは、最初に蛍光顕微鏡で30分後に検出することができます。個々の細胞は低倍率で検出するのが難しい場合がありますが。誤った希釈比で調製された細菌細胞培養物は、不変の数の細胞を示し、プレートシールなしで調製したサンプルは過度の収縮を示し、その結果、焦点が失われる可能性があります。
細胞はまた、栄養素を求めてゲルをインデントし、細菌細胞を互いに積み重ねて細胞単層を損なう結果、細胞検出と信頼性の高い蛍光シグナル測定を効果的に防止することができます。これらのデータによって示されるように、面積の異なる範囲が同じ傾向を示すため、除算周期のセルステージはノイズレベルに影響を与えません。また、これらの代表データに示すように、GFPとスーパーフォールドGFPの間では、信号対雑音比の大きな変化は認められない。
この手順を実行する場合、実験に使用する細菌株の正しい希釈比を決定するように注意してください。各規制回路の信号対雑音比をこの基準線と比較すると、最適な性能回路の選択が可能となり、興味深い現象を明らかにすることができます
