JMDとMKBは、ノースイースタン大学（NCIとNSFの助成DGE - 0504331からの資金）でIGERTのナノメディシンの科学技術プログラムを通じて資金が賄われています。この作品は、一般医科学グラントR01 GM084366の健康国立研究所の国立研究所によって資金を供給された。我々はまた、動物のプロトコルの開発における彼の貢献のために心筋細胞とケビンの現金を提供するためにボストンでBIDMCのSaumyaダスとアンソニーローゼンツヴァイに感謝。

1。 optodeの準備 optodeを行う前に、コンポーネントのアリコートは、それらが容易に測定し、保存することができるよう、必要です。 <ol><li> 50 mgのナトリウムイオノX（NaIX）バイアル、50 mgのナトリウムテトラキス[3,5 - ビス（トリフルオロメチル）フェニル]ホウ酸（NaTFPB）各tetrahyrdofuran（THF）で育ったと1.5 mlのポリスチレン遠心管に分注しされます。化学煙フードでは、出荷のバイアルにTHF 1mlにNaIXの50 mgを溶解し、固体が完全に溶解していることを確認するために混ぜる。 10個の分離した遠心チューブにこの溶液100μlを移す。 NaTFPBについて繰り返します。 THFは、一晩化学ドラフト内で蒸発させる遠心チューブにラベルを付けたり、保管のための4度の冷蔵庫でそれらを配置することができます。これは、乾燥NaIXとNaTFPBの5mgのアリコートを作成します。 </li><li> THF 1mlにChromoionophore III（CHIII）を溶解し、3 mlのガラスバイアルに移す。任意の残留CHIIIを溶解し、3 mlのガラスバイアルにこれを追加するCHIIIの出荷のバイアルにTHFの別の1 mlの。現在2 mlの合計があるでしょう。テフロンコーティングされたキャップを持つ2つの別々の1.5 mlガラスバイアルにTHF溶液中でCHIIIの1 mlを入れる。 5 mg / mlの最終濃度で4度の冷蔵庫でCHIIIソリューションを保管してください。 </li></ol>これらのアリコートとソリューションはoptode材料を作るために使用されます。 <ol start="3"><li>ピペットテフロンコーティングスクリューキャップ付1.5 mlのガラスバイアルにビス（2 - エチルヘキシル）セバケート（DOS）の66μlを - これはoptodeバイアルです。 DOSは、粘性の溶液ですので、バイアルに移しているソリューションの適切な量を確保するよう注意しなければならない。ボリュームは、DOSの約60 mgに対応しています。 </li><li>高分子量ポリ（ビニル）塩化ビニル（PVC）の30 mgを秤量し、optodeバイアルにこれを転送する。 </li><li>今必要なoptodeを作成するoptodeバイアルに分注し、機能コンポーネントを追加します。 CHIII、NaIX、およびNaTFPBの相対濃度は、ナトリウムに対するセンサーの応答を決定します。これらの濃度は、理想的には150mMのKdを、10mMの、または細胞外濃度のKdで、濃度を細胞内に応答するセンサーを持つように調整することができます。さらに、おそらく正しい応答が化学成分のそれぞれの新しいバッチのために発生しているかどうかを判断するために必要なセンサーのベンダーとキャリブレーションから、化学薬品のバッチ変動へのバッチがあるでしょう。ここでは、通常、細胞内のナトリウムの測定に使用される濃度とセンサーを作成する方法を説明します。 </li><li>化学煙フードでは、optodeバイアルへのTHF溶液に5 mg / mlのCHIIIの100μlを移す。 </li><li> THF 300μlでNaIXの5mgを溶解し、NaIXの5mgにこの相関、optodeバイアルに300μlを移す。 </li><li> THF500μlにNaTFPBの5mgのアリコートを溶解し、NaTFPB 0.1mgのにoptodeバイアル、この相関に溶液20μlを転送する。 </li><li> optodeバイアルにTHFの80μlを添加する。 </li><li> optodeバイアル内の溶液は、塩ビ、DOSの60mgの、NaIX、NaTFPB、THF500μlのでCHIIIのは0.5mg 0.2mgの5 mgの30 mgを含んでいます。穏やかにボルテックスこのバイアルは、PVCのすべてになるまで溶解した。 optodeは赤い色になります。バイアルに加えTHFの合計金額に関係なく使用されるコンポーネントの割合の500μLにする必要があります。 </li><li> NaIXとNaTFPBアリコートの残りのTHFが化学物質の適切な量で一晩、再ラベル管を蒸発させる。 </li></ol> 2。ナノセンサーを作成する<ol><li> 10ピペット100μlのmg / mlの1,2 -ジステアロイル- sn -グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン- N - 4ドラムのガラスバイアルにクロロホルムで[メトキシ（ポリエチレングリコール）-550]（PEG脂質）。クロロホルムは化学ドラフト内で蒸発させる。このプロセスは、窒素ガスや家の空気を持つソリューションを乾燥させることにより迅速なすることができます。 </li><li> PEG -脂質とのバイアルに、目的の水溶液4mlを追加します。超音波処理の先端の下に研究室ジャックにバイアルを置き、先端が30秒間の低超音波の力で解決し、超音波処理の深さ7ミリメートル程度になるまで、バイアルを上げる。ここでは、½インチの先端径のステップ角で15％の振幅に設定さブランソンデジタル超音波処理を使用してください。水溶液は、すべてのソリューションにすることができます。例えば、我々はtrizmaベースと10mMのHEPES緩衝液pH 7.2を使用するセンサーの応答を決定する。 </li><li>ソリューションを超音波処理されている間、0.6 mlのマイクロ遠心チューブにジクロロメタン50μlとoptode材料の50μlを混合する。さらにミキシングを確保するために、ピペットで混ぜる。 </li><li> 3分間超音波処理する超音波処理のコントロールを調整します。超音波処理を起動し、超音波処理しながら溶液中にピペットチップを浸漬し、手っ取り早い、さらに注射で溶液100μlを分注してバイアルにoptode混合溶液を加える。解決策は、青、depeを有効にしてください使用される水溶液にnding。 </li><li>超音波処理は、その後約30秒間継続する超音波処理チップが溶液中で深さ約2mmになるようにジャッキを下げることができます。これにより、ソリューションを曝気を開始する必要がありますし、解決策が不透明になります。このステップでは、液から残留THF、ジクロロメタンを除去するのに役立ちます。 </li><li>超音波処理が完了すると、5mlシリンジにナノセンサーソリューションを引き上げます。 0.2μmのシリンジフィルターを取り付け、スクリュートップキャップ付きガラスバイアルにナノセンサーソリューションを分注する。 10mm未満のナトリウムが含まれており、約9未満のpHを有する水溶液が使用されている場合、溶液は透明とブルーになります。そうでなければ、それは色がないかピンクにする必要があります。 </li></ol> 3。 nanonsensor応答の決定このメソッドは、細胞内のナトリウムを測定するために設計されたナノセンサーの応答を決定するために使用されます。異なる濃度は、細胞外ナトリウム濃度のナノセンサーに使用することをお勧めします。 <ol><li> 10 mMのHEPES（0 NA）と10mMのHEPES（1 M Na）をし、pH、これらのソリューションの各7.2〜trizmaベースを使用して1Mの塩化ナトリウム（NaCl）のストック溶液を作る。 0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000 mMのNaCl濃度：でソリューションを作成するために50 mlコニカル遠心チューブに0のNaと1 M Naのストック溶液を混ぜる。 </li><li>応答を決定するために光学底96ウェルプレートを使用してください。列の3ウェルにナトリウムのそれぞれの濃度の100μlを追加。これは3 × 10ウェルの配列を生成します。 </li><li>各ウェルマイクロプレート蛍光光度計に作りたてのナノセンサーと、負荷の100μlを加える。我々は、分子デバイスSpectramax M3を使用してください。 </li><li>以下の波長で各ウェルを読む： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 励起（nm）の </td><td> 放射（波長） </td><td> カットオフ（NM） </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table>各波長におけるナノセンサーの強度は、ナトリウム濃度に依存しています。波長の使用は、アプリケーションに依存します。細胞内のスローダイナミクスの測定では、我々は488 nm/570 nmの（励起/発光）と比率2つの波長をするために私達を許可し、ノイズを低減488 nm/670 nmを使用して。 <ol start="5"><li>伝統的に、optodeデータがある値に変換されます：α=（I - I 分）/（I maxと-私分 ）、私は与えられたナトリウム濃度で強度です、私は分が応答測定における最も低い強度である、そして私の最大の応答測定における最高の強度です。強度の比は、670 nmの強度やαから680 nmの強度で割った値570nmでのどちらかに変換します。 </li><li>作図用ソフトウェアを使用して、Excelや起源のどちらかが一般的に-1にゼロナトリウム濃度のログを設定し、ナトリウム濃度の対数対αをプロットするために、私たちのラボで使用されています。応答にS字状曲線をフィット。曲線から、センサーが最適に応答する濃度を表すα= 0.5でのナトリウム濃度を計算する。 </li><li>興味のナトリウム濃度の周りに最適な応答とナノセンサーを作成するoptodeでCHIII、NaIX、およびNaTFPBの比率を調整します。 </li></ol> 4。細胞内イメージング<ol><li>細胞内の測定では、ナノセンサーは、水中に5 mg / mlのグルコースで行われ、細胞にマイクロインジェクション。 </li><li>成長やガラス底皿やガラスのカバーの底部と画像処理チャンバーに細胞を移す。 </li><li>明確なメディアやタイロード液で細胞をインキュベートする。落射蛍光顕微鏡に画像処理室や料理をマウントします。我々はツァイスLSM 7共焦点顕微鏡を使用してください。 </li><li>ピペットプラーとガラスキャピラリーを引き出します。我々は300から500 nmの最終的な先端径には、1mm径、0.78 mm内径のガラスと茶色のp - 97燃えるサターを使用してください。 </li><li>埋め戻しナノセンサーシリンジとハミルトンの針を使用してソリューション、またはマイクロチップローダーとピペットとピペット。 </li><li>マイクロマニピュレータに取り付けられ、圧力制御噴射システムに接続されているホルダーにピペットをマウントします。ここでは、バーレイEXFOのPCS 6000マイクロマニピュレータとメディカルシステムズ株式会社インジェクタを使用してください。 </li><li>セルの上にピペットを下げ、細胞質中に、時にはそれがピアスに膜をマニピュレータのホルダーを&quot;タップ&quot;する必要があります。ナノセンサーソリューションを注入し、迅速にピペットを撤回。 </li></ol> （5）in vivoイメージング すべての手順は、ノースイースタン大学の動物実験委員会によって審査され承認されている。 <ol><li>ナノセンサーin vivoでのために、細胞外イメージングは、リン酸塩で作られている緩衝生理食塩水および135 mMのナトリウム濃度のナトリウムに対する最適な応答を持つように調整。 </li><li>インジェクションのセットアップとマウスの蛍光ナノセンサーのイメージングのため、我々は、IVISルミナIIおよびそれに関連する麻酔のユニットを使用してください。誘導とイメージング室を消毒する。誘導チャンバ内の場所CD1ヌードマウス（約20グラム）とイソフルランにそれらを公開する。 投与イソフルランと酸素流量の割合は、マウスの種と重量によって異なりますが。完全に麻酔になるためにマウスのを待ちます。 </li><li>マウスに麻酔をしたら、画像処理チャンバー内に誘導室と場所からマウスを取り外します。麻酔下でマウスを保持します。それぞれのマウスの場合は、希望する注入領域を消毒する。 </li><li>すべての気泡を除去することを確認してナノセンサーの10μLを滅菌した31Gインスリン注射器を埋める。 </li><li>鉗子を使用して、目的の注射部位でのマウスの背面に沿って皮膚の小さな倍を把握する。皮膚をつかんで、上向きにベベルと皮膚と皮膚に針を平行に注射器を挿入する。 </li><li>センサーを注入する前に、針が血管内に挿入されないようにシリンジのプランジャーを後方に引いて。その後、そっと針を右に移動し、皮膚内ポケットを作成するために残しました。これは、センサーが注射部位から漏れする原因となる背圧を最小限に抑えることができます。センサーを注入し、静かに注射器を取り外します。 </li><li>ゆっくりと注射部位に圧力を適用し、注射部位から漏出した可能性のあるソリューションを拭き取ってください。これは皮膚に注入されていないセンサーからの蛍光が最小限に抑えられます。 </li><li>希望の注入領域の数に達するまで繰り返されますから5.7 5.4繰り返します。均等にバックの左側と右側に間隔をあけ六注射部位が推奨されています。針が皮膚に挿入することが困難になった場合、個々のマウスの場合は、針を変更してください。 針はマウス間で共有すべきではない。これは、マウスの間で病気の伝送やクロスコンタミネーションを最小限に抑えられます。 </li><li>イメージングナトリウム蛍光センサについては、我々は、最も近い640 nm/680 nmの（励起/発光）ナノセンサーのスペクトルに一致し、それはまた、皮膚の自家蛍光を最小限に抑えるフィルターセットを使用してマウスの明視野および蛍光イメージの両方を取得する。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。ナトリウムの5種類のナノセンサーセットの応答曲線。各セットはCHIII、NaTFPB、PVCとDOSの同じ量だけNaIXの様々な量を持っていた別のoptode製剤からナノセンサーを表します。データは、680分の639 nmの強度を用いてα値に変換されていました。データは、Originを使って近似S字カーブで、明確に省略さ3、エラーバーの平均です。この応答曲線では、使用されるナトリウムの最大濃度は500 mmであった。ナトリウム、ナトリウムのナノセンサーのKdは、10mM（オレンジ色のダイヤモンド）から約150mm（黒い正方形）の範囲であった。 <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="図2"/> 図2新生児心筋細胞を注入した。細胞は、顕微鏡に装着され、ナトリウムのナノセンサーを注入、カバーガラス上で培養した。蛍光（639 nm励起）、明視野、およびオーバーレイも表示されます。いくつかのセンサーのクラスタリングが発生するが、細胞が正常な形態を持って、センサーは細胞質全体に拡散しているとは核の負荷がないことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="図3"/> ナトリウムのナノセンサーを持つマウスの図3。皮下注射。ナトリウムのナノセンサーの9種類の注射は、ヌードマウスの皮下空間に作られた。明視野と蛍光像（680分の640）の両方が重ね合わされる。

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P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors.">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li><li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. 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A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells.">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging.">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

optodeソリューションが行われ、PEG脂質は乾燥された後、ナノセンサーの形成は、10分以上も時間がかかるはずです。必要なときOptodeだけ迅速に行うことはできませんが、摂氏4度で保存した場合、彼らは数ヶ月のために安定させることができる。しかし、ケアは光からナノセンサーをブロックすることにより、この時間の経過とともに退色を防止するためにとるべき6ナトリウムのナノセンサーは、ここに示されたが、optodesがされている;。私たちは、一度形成nansensorsが、、少なくとも1週間溶液中で安定であることが示されているこのようなカリウムと塩化物のようなほとんどの生物学的に関連するイオンのために作成。10,12また、グルコースなどの小分子には、この技術を拡張しました。13 別の検体を監視するためのナノセンサーを生成するだけでなく、これらのナノセンサーは、ほとんどの生物学的実験において、それらを有用になるその他の変更に適している。例えば、表面コーティングが、この場合、ポリ（エチレングリコール）は、容易に水溶性である任意の両親媒性分子を使用して変更することができます。これにより、異なるアプリケーションまたはターゲットのためにこれらのナノ粒子を官能の可能性を可能にします。ナノ粒子のサイズは、表面コーティング、超音波処理の強度や溶剤を変えることによって調整することができます。 カルシウム蛍光指示薬は、細胞内カルシウムシグナル伝達を決定する上で非常に貴重されているが、使用可能なナトリウム感受性色素は同じ理想的な特性を持っていません。 Optodeは、我々は、うまくいけばナトリウムのシグナル伝達が細胞機能に影響を与えるかを理解するための手段を提供する細胞内のナトリウムのイメージングのための特定のナノセンサーを作成するには、この以前の研究で構築されている14。細胞内に年間の開発にされているイメージングイオンのための代替方法を提供することを目的とナノ粒子特定の疾患につながるシグナル伝達の変化。 in vivoでの蛍光ナノセンサーの使用は、血液が描くような他の方法より分析物を監視するためのリアルタイムの低侵襲代替手段を提供しています。上記の技術に基づいて3ナトリウムとブドウ糖ナノセンサーは、ナトリウムとブドウ糖の変化を追跡することが示されている、それぞれの生体 。3,13はしかし、現在、監視ツールとしてこの方法に制限が存在する。例えば、センサーは十分に皮膚からのバックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために、赤近赤外にシフトスペクトルを持つ蛍光体が含まれている必要があります。15秒、電流注入法などによって発生する可能性があるナノセンサーの均一な注入を生成しない注入の深さのばらつきなどのエラー。これらの制限があるにもかかわらず、これらの蛍光ナノセンサーとその成功デモの開発は、患者の健康状態を監視するため、これらのセンサーは非常に貴重な研究ツールと方法することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>製品名</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> IVISルミナIIのインストゥルメントのパッケージ</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD - 1ヌードマウス</td><td>チャールズリバー</td><td>ひずみコード：086 </td><td>免疫不全</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3月10日CC mLを 、8mmの31G </td></tr><tr><td>高分子量ポリ塩化ビニール</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaIX </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄壁ガラスキャピラリー</td><td>サター</td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1は、この手順で使用する化学物質や機器のリストを提供します。記載されていないすべての一般的な化学物質はSigmaから購入した。

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

体全体に厳密に制御イオンの恒常性は、脱水などのような衰弱状態の予防に必要です。対照的に1が 、細胞レベルでの迅速なイオンフラックスが興奮性細胞の活動電位を開始するために必要な2ナトリウムの規制は、の両方で重要な役割を果たしているこれらのケースは、しかし、方法は現在、継続的に生体 3と4は、カルシウムプローブと同様の詳細な結果を提供していない細胞内のナトリウムのプローブでナトリウム濃度を監視するために存在しません。これらのボイドの両方を埋めるための努力では、蛍光ナノセンサーは、in vitroおよび in vivo でのナトリウムの濃度を監視できるよう開発されている。5,6これらのセンサは、イオン選択optode技術に基づくとのナトリウム特異的認識可塑化ポリマー粒子で構成されています要素、pH感受性蛍光色素、および添加物が埋め込 ​​まれている。7-9機構的に、ナトリウムの認識要素は、センサーにナトリウムを抽出します。10この抽出が引き起こすセンサ内の電荷の中立性を維持するために水素イオンを放出するpH感受性蛍光体を起こす蛍光の変化。ナトリウムセンサーは、彼らの直径は約120nmである6。高い細胞内濃度でもカリウムを介してナトリウムを元に戻せると選択的であると生体適合性を付与するためにポリエチレングリコールでコーティングされています。マイクロインジェクションの技術を使用して、センサーは、それらが心筋細胞の拍動の時間的および空間的なナトリウムの動態を監視することが示されている細胞の細胞質内に送達することができます。注入した場合、さらに11彼らはまた、in vivoでのナトリウム濃度のリアルタイムの変更を追跡している皮下マウスへの3ここでは、我々は詳細に説明すると蛍光灯、ナトリウムのナノセンサーを製造するための方法論を示し、簡単に私たちの研究室がためにナノセンサーを使用する生物学的用途を示しています：。細胞内へのセンサーのマイクロインジェクションを、そしてマウスへのセンサーの皮下注射。

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

私たちの研究室で生産された蛍光ナノ粒子は、そのような生理的恒常性の間のシグナリングおよび間質液中の細胞のような生物学的システムにおけるイメージングイオン濃度とイオンのフラックスに使用されます。

生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.2K ビュー.  Northeastern University. 私たちの研究室で生産された蛍光ナノ粒子は、そのような生理的恒常性の間のシグナリングおよび間質液中の細胞のような生物学的システムにおけるイメージングイオン濃度とイオンのフラックスに使用されます。

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

ティッシュエンジニアーコンストラクトの成長評価のための磁気共鳴エラストグラフィの方法論

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

生物工学

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

小角中性子回折計KWS-2でのナノおよびマイクロメータサイズからワイド長さスケール上でソフトマターと生物学的システムを学びます

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

偏光ゾーンの伝播を遮断するように並置されたイオン交換膜との間のイオン濃度分極のマージ

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

脳血流をモニタリングするための機能性経頭蓋ドップラー超音波

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...