ブタ卵母細胞のカプセル化のためのこのプロトコルは、COCsの球状組織を維持することを可能にする。これにより、卵母細胞と周囲の濾胞細胞との間のギャップ接合の平坦化と結果的な中断を防ぐことができます。2つの記述されたプロトコルの主な利点は、ユーザーフレンドリーであり、卵母細胞およびケモ細胞生存の両方の効果的な制御を可能にするものである。
両方の培養システムは、生殖生物学の基礎研究のための貴重なツールであり、改善された不妊治療のための臨床的関連性を持っている可能性があります。また、新しいバイオテクノロジー手法の開発や家畜の改良にも応用できます。卵巣をすすいた後、HM培地で満たされたビーカーに移し、その後のすべての操作中に摂氏38度のインキュベーターに保管します。
大きな豚の卵胞から濾胞液を吸引し、室温で10分間Gの100倍の遠心分離機を使用します。その後、0.2マイクロメートルの膜細孔フィルターに取り付けられた滅菌シリンジを使用して上清をろ過し、80°Cの負の80度で凍結します。中型卵胞からCOCを分離するには、2〜3個の卵巣をHMで満たされた無菌10センチメートルのペトリ皿に移します。突き出た卵巣卵胞の表面を無菌手術番号15のブレードで静かに切断し、濾胞液とCOCがペトリ皿に流れ出る原因となります。
使い捨ての注射器に取り付けられた28ゲージの針で濾胞の内容物を吸引し、それを別のペトリ皿に移す。IVFペトリ皿を準備するには、中央の井戸にHMの1ミリリットルを追加し、外側のリングにHMの3〜4滴を置きます。次に、ポリカーボネートマイクロピペットを使用して、損傷していないCOCを外輪のHMの滴に移動させ、3〜4回簡単にリンスします。
終了したら、個別に中央の井戸に転送します。IVFプレートをインキュベーターに保管します。テキスト原稿に記載されているように、トロンビンおよびフィブリノーゲン溶液を準備する。
手順の日には、氷上でフィブリノーゲン溶液をゆっくりと解凍し、使用する直前に室温に持ち込みます。0.5%アルギン酸溶液とフィブリノーゲン溶液を1対1の比率で混合し、2ミリリットルの最終体積を求め、混合物を穏やかに渦巻く。ガラス顕微鏡スライドにパラフィンフィルムの薄いストリップを適用することにより、インキュベーションチャンバーを修復します。
FA混合物のピペット7.5マイクロリットル滴を分離スペーサー付きパラフィンフィルムコーティングガラススライド上に、2列に配置して8〜10滴を配置した。マイクロピペットを使用して、3~5個のCOCをFAドロップの中心に転送し、最小量の成熟媒体を加えます。それをカバーするために各FAドロップの上にトロンビン溶液の7.5マイクロリットルを追加します。
ゲルはほぼ瞬時に形成されるため、それらを混合する必要はありません。インキュベーションチャンバーを以前に準備したガラススライドで覆い、チャンバーを逆さまにして、湿ったろ過用紙が並ぶ100ミリメートルのペトリ皿に入れます。ペトリ皿を摂氏38度のインキュベーターで5%の二酸化炭素に5〜7分間入れます。
インキュベーション後、各FAカプセルを100マイクロリットルの成熟培地を含む96ウェルプレートのウェルに移します。2日ごとに、培地の半分を新鮮な事前平衡熟成培地に置き換えます。画像COCは、10倍倍率で反転光顕微鏡を使用しています。
COCを4日間培養した後、ウェルから成熟培地を取り出し、DMEMに1ミリリットルのアルジネートリセートあたり100マイクロリットルの国際単位を加えます。培養プレートをインキュベーターに25~30分間放置します。溶解したカプセルからCOCを取り出します。
DMEMで数回洗浄し、PBSを含むIVF皿の内輪に移します。30ミリメートルペトリ皿でFEP粉末の5グラムのベッドを作ります。FEP粉末に3~5個のCOCを含む成熟培地の単一の液滴を分配します。
プレートを円状に回転させて、粒子が液体の落下の表面を完全に覆い、液体大理石を形成するか、またはML.数60ミリメートルのIVFペトリ皿を準備し、3〜4ミリリットルの無菌水を外側リングに加えて湿度チャンバーを作ります。1000マイクロリットルピペットで形成されたLMをピックアップし、中央の井戸に置きます。
5%の二酸化炭素インキュベーターで38°Cで4日間大理石をインキュベートします。培地を変更するには、各LMに30マイクロリットルの成熟培地を塗布し、それが広がります。大理石の内容物が溶解したら、バイオリアクターから放出されたCOCsをペトリ皿の新鮮な成熟培地の滴に移します。
成熟培地で3〜4回のスケーションを行った後、COCを30マイクロリットルの新鮮な培地とともにFEPパウダーベッドに移します。粉末粒子が液体の落下の表面を完全に覆い、新しいLMを形成するように、円運動でプレートをそっと回転させ、次に、LMをIVFペトリ皿に移します。両インビトロ成熟システムは、互いに密着した顆粒球細胞とcumulus細胞の無傷の層を持つCOCを産生した。
COCの生存率分析により、両方のカプセル化システムで最適な成長条件が達成されたことを確認しました。両方の群では、高生存率の卵母細胞部位のみが観察された。卵母細胞を透過電子顕微鏡で画像化した。
ミトコンドリアは均等に分布し、シェルのような形をしていました。そのうちのほんの一部だけが細長く、彼らのクラスタリングは散発的に観察された。小胞子は、ミトコンドリアに関連するか、卵母細胞細胞質中で自由であった。
液体滴は小さく、暗く、丸い構造として現れ、ゴルジ装置は拡張された水槽で出現した。FAカプセルを培養チャンバーから培養プレートに移す際や、形式LMをIVFペトリ皿に取り込んで転送する際には、正確かつ注意することが重要です。
