本研究は、文部科学省、科学技術（NRF-2013R1A1A2012159とNRF-2013R1A1A2007561）、建国大学、化学工学やMCubed省によって資金を供給、韓国の国立研究財団（NRF）を介して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていましたミシガン大学のプログラム。

1.全細胞生体触媒の調製注：組換えE. pET28a- SpNox 31またはpET28a- HjLAD 28を保有する 大腸菌細胞を、以下、Eと呼ばれています大腸菌SpNoxとE.大腸菌HjLAD、それぞれ。 <ol><li> E.の単一コロニーを接種しますルリア-ベルターニ（LB）培地3ml中の大腸菌 HjLADはカナマイシン（50μg/ ml）を補充し、37°C ​​の 、250rpmでインキュベーターシェーカーO / Nでインキュベートします。 </li><li> 50μg/ mlのカナマイシンを含有する新鮮なLB 200ml中に100とOD 600が 〜0.6に達するまで37 O C、250rpmでインキュベートする：1により培養を希釈します。 </li><li>培地に0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することによりHjLADタンパク質発現を誘導し、16 O C、16時間、180rpmでインキュベートします。 <ol><li>また、25°Cの 、200 RPで誘導を行います6時間メートルL-キシルロース生合成（下記のステップ2）が同じ日に行われた場合。 </li></ol></li><li>誘導された大腸菌を収穫4 O℃で20分間、3200×gで遠心分離により大腸菌 HjLAD細胞上清を捨て、細胞ペレットを処理するために、ステップ2に進みます。 </li><li> E.のための1.4 -並行して、ステップ1.1を実行大腸菌 SpNox。 </li></ol>カップリングE.によるL-キシルロースの2生合成大腸菌 HjLADとE.補因子再生のための大腸菌 SpNox <ol><li> 大腸菌の細胞ペレットを再懸濁大腸菌 HjLADとE.コリ SpNox別々に50 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）5.0 g乾燥細胞重量（gDCW）/ Lの細胞密度で。 注：gDCWから600nm（OD 600）で測定した光学密度との相関関係は、実験を容易にするために確立することができます。において使用される式異なる分光計によって異なる場合があります0.0965、 -このプロトコルは、1 gDCW / L = 0.722 * OD 600です。 </li><li> 5.0 gDCW / L Eの600μLをミックス大腸菌 HjLAD、5.0 gDCW / L E.600μlのコリ SpNox、20mMのNAD +を100μl、および14 mLの丸底チューブ内の2 MのL-アラビニトール150μlの50 mMトリス-塩酸（pH8.0）を550μlずつ添加することによって、2 mlまで反応容量をもたらします。 注二つ全細胞生体触媒量の比は、生成物の生合成を改善するために最適化することができます。記載されているシステム、Eの比率のための大腸菌 SpNox：E.コリ HjLAD = 1：1のLキシルロース生合成（ 図1B）のために最適であることが見出されました。 </li><li> 30 Oは C、8時間、200rpmで反応混合物をインキュベートします。 </li><li> 、4°Cので遠心分離後の上清を回収し3200×gで10分間aについてndは以下の手順3で説明したように、L-キシルロース生産を定量化するために進んでください。 </li></ol> L-キシルロース定量化のための3比色アッセイ<ol><li>吸引し1.5mlチューブにステップ2.4​​から収集した反応上清100μl。 </li><li>エタノールに溶解し、1.5％のシステインを50μl、70％硫酸を900μlの、および0.1％のカルバゾールの50μlを添加し、チューブを3回転倒混和します。 </li><li> 37 O C、20分間200rpmで反応混合物をインキュベートします。 </li><li>分光光度計を用いて560nm（560）で反応混合物の吸光度を測定します。 <ol><li> A 560読み取り値が1を超える場合、反応混合物を希釈します。 </li></ol></li></ol>アルギン酸カルシウムビーズにおける組換え全細胞触媒の4固定化<ol><li> 100mlの蒸留水に4gのアルギン酸ナトリウムを溶解します。 Sを加えることによりアルギン酸塩溶液を調製します塊の形成を回避するために水に憎悪アルギン酸。必要に応じて、混合液を加熱しました。 </li><li> 5.0 gDCW / L Eの600μLを追加大腸菌 HjLADおよび5.0 gDCW / L E.600μlの1.2ミリリットルの4％アルギン酸塩で大腸菌 SpNoxは、ステップ4.1で調製し、気泡の形成を避けるために、穏やかなピペッティングにより細胞およびアルギン酸塩を混ぜます。 </li><li>連続的に攪拌しながら100ミリリットルのビーカー中（のCaCl 2）溶液を注射針を用いて注射器にアルギン酸/細胞懸濁液を吸引し、0.3 M塩化カルシウムに滴下混合物を追加します。 注：アルギン酸塩の液滴が完全に水没するためのアルギン酸ビーズ形成のために使用される塩化カルシウム溶液の量が十分でなければなりません。また、注射針および塩化カルシウム溶液の表面との間の距離が均一に球状のビーズの形成を確実にするために最適な範囲内に維持されなければなりません。最適な距離範囲は、実験を決定することができます同盟国とは、針の内径に依存します。推定として、〜15±5cmの距離0.6 cmの（内径）注射針のために最適であることが見出されました。 </li><li>架橋およびゲルビーズの形成を可能にするために撹拌することなく室温で3時間- 2のためのCaCl 2溶液中のビーズを残します。 </li><li>慎重に50ミリリットルコニカルチューブに塩化カルシウム溶液を注ぐことにより、ビーズを乱すことなくのCaCl 2溶液をデカントし、そして別の50mlコニカルチューブに塩化カルシウム溶液中に残っているビーズを転送します。 </li><li>過剰のCaCl 2および非カプセル化細胞を除去するために3回の緩衝液を50mMトリス-HCl（pH8.0）10mlでビーズを洗浄します。 注意： 任意のステップで、それらを破裂するようにすることなどのビーズを遠心分離しません。 5分 - 溶液からビーズを分離するために、サスペンションは3静置することができます。ビーズを底部に沈降し、洗浄緩衝液をデカントすることができ別の容器に。 <ol><li>使用する洗浄緩衝液を廃棄しないでください。ステップ4.5から収集した使用済みのCaCl 2溶液で使用トリス塩酸洗浄緩衝液（30ミリリットル）をプールします。 </li></ol></li><li>非固定化されたE.ペレットプールされたのCaCl 2およびトリス塩酸溶液を遠心分離により大腸菌細胞を20分間3200×gでステップ4.6から収集しました。ステップ2.1で説明したように固定化効率を決定するために、gDCW / Lでペレット化し、非カプセル化された細胞の密度を計算します。 </li><li>チューブにステップ4.6から洗浄したビーズを転送します。手順2.2に従ってください - 3.4を細胞ペレットの代わりに、洗浄したビーズの全てを用いたL-キシルロース生合成を評価します。 </li></ol> L-キシルロース生産のための固定化生体触媒の5安定性アッセイ<ol><li>ステップ4.8からビーズを収集し、（ステップ4.6で説明したように）遠心分離することなく、50mMのトリス-HCl（pH8.0）緩衝液10mlで二回洗浄します。 </li><li>すべての使用3.4 - 工程2.2に記載のように洗浄したビーズの反応を実行します。 </li><li>生産サイクルの所望の数の5.2と各サイクルにおける反応上清中に産生さL-キシルロースの量を測定する - 繰り返して、5.1を繰り返します。 </li></ol>

著者には、競合する金融利益を宣言しません。論文は、アルギン酸ビーズに固定化された結合された全細胞生体触媒システムを生成するための詳細な方法論を報告することを目指しています。科学的なノベルティは以前の研究16に報告されています。

最近の技術の進歩は、バイオテクノロジー産業における市場価値の緩やかな上昇をもたらし、組換え生物学的治療薬の商業化の急増を有効にしています。そのような進歩は、スケーラブルな産業システム38の確立に大きな期待を示している組換え微生物中で代謝工学の出現です。ほとんどのプロセスと同様に、遺伝子操作された微生物により産生された組換え生体分子の成功した商業...

3 -微生物を使用する還元全細胞生体内変化は、商業的および治療 ​​的に重要な生体分子1の化学酵素合成のための普及した方法となっています。 7 -それは孤立した酵素の使用に比べていくつかの利点、特にコストのかかる下流の精製工程の排除と長寿命4のデモを提示します。補因子は、生成物の形成に必要とされる生体触媒の経路のために、全細胞系は、安価な電子供与共基質5,8,9の添加によってその場での補因子再生に提供する可能性を有します。 13 -しかし、この容量が希少または高価な補基質10の化学量論的濃度を必要とする反応のために減少します。一緒に細胞全体の貧しい再利用して、これはスケーラブルで連続のproduの確立を妨げますctionシステム。これらの補因子依存性生物変換のための全細胞システムの戦略的な改変は、前述の制限を克服するために必要とされます。具体的には、協働して動作する全細胞生体触媒の組み合わせは、有意に保有酵素14の生産性及び安定性を高めることが示されています。多くの場合、商業的に実行可能な製品の大量生産を可能にするために重要であり、これらの因子は、共固定化生体触媒微生物15によってさらに最適化することができます。我々は最近、L-キシルロース生産の16のための補因子再生と生体触媒の固定化の両方を可能にする、シンプルで再利用可能な全細胞生体触媒システムを開発しました。この研究では、このシステムは、改善された生体内変換歩留まりと生体触媒の再利用のために、これら2つの戦略を適用する実験手順を説明するための例として使用しました。 L-キシルロースは、CLAに属し生物学的に有用な分子のssは希少糖と命名します。希少糖は、自然の中で非常にまれにしか発生しないユニークな単糖類または糖誘導体であるが、生物活性分子17,18における認識要素として重要な役割を果たしています。彼らは、甘味料、機能性食品からの潜在的な治療薬19に至るまでのさまざまなアプリケーションを持っています。 Lキシルロースは、複数のαグルコシダーゼの潜在的な阻害剤として使用することができ、また、肝炎または肝硬変17,20の指標として用いることができます。全細胞系におけるLキシルロースをキシリトールの高効率変換をパントエアで以前に報告されているが21,22、 アルカリゲネス属 アナナティス 。 701B 23、 バチルス・淡蒼球 Y25 24,25および大腸菌（Escherichia coli）26。 E.で大腸菌は、しかしながら、それは唯一の原因で1よりも初期のキシリトール濃度の潜在的阻害効果に低い（&lt;67 mM）のキシリトール濃度26を使用して達成されましたキシリトール-4-デヒドロゲナーゼ活性21,26上の00 mMの。キシルロースおよびキシリトールの間の熱力学的平衡を強くキシリトール25,27の形成に有利に働くことが示されています。さらに、キシルロース収率は、 その場 で補因子再生系の非存在下で供給されなければならない高価な補因子の量によって制限されます。一緒に、これらの要因は、L-キシルロース生合成のための持続可能なシステムにスケーリングするための可能性を制限します。 これらの制限を克服し、L-キシルロース生体内変換の収率を改善するために、補因子再生の戦略は、結合された全細胞生体触媒システムを確立することにより最初に使用しました。具体的には、 ハイポクレアジェコリーナ （HjLAD）、菌類のL-アラビノース異化経路中の酵素からのL-アラビニトール4-脱水素酵素（EC 1.1.1.12）は、L-キシルロース28,29にL-アラビニトールの変換を触媒するために選ばれました。多くの生合成酵素と同様に、主要なlimitatioHjLADのNは、この変換を実行するために高価なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補助因子（NAD +、NADHの酸化型）の化学量論量を必要とすることです。 化膿連鎖球菌 （SpNox）で見つかったNADHオキシダーゼは、高い補因子再生活性30,31を表示することが示されています。 SpNox、Eのこの属性を利用してLキシルロースの産生のためHjLADを発現する大腸菌細胞は、Eに結合されました図1（a）に示す結合された反応によって示されるL-キシルロース生産を後押しするNAD +の再生のためにSpNoxを発現している大腸菌細胞。最適な条件と150 mMのL-アラビニトールの初期濃度を使用して下に、最大Lキシルロース収率は、このシステムは、はるかに効率的な文献に報告されたものよりも製造、96％に達しました。 全細胞固定化の戦略がさらに結合されたbiocatalytの再利用性を高めるために、次の使用しましたICシステム。全細胞固定化のために一般に使用される方法は、高分子ネットワーク32内の架橋/捕捉およびカプセル化を固体マトリックスにリンク吸着/共有結合が含まれます。これらのアプローチの中で、細胞の固定化のための最も適切な方法は、カルシウムアルギネートビーズ中のカプセル化です。その穏やかなゲル化特性、不活性水性マトリックスおよび高気孔率は、カプセル化された生物学的製剤33の生理学的特性と機能を維持するのに役立ちます。 E.両方を含むため、結合された生体触媒システム大腸菌 HjLADまたはSpNoxをL-キシルロース生産の複数のサイクルを有効にするには、アルギン酸カルシウムビーズに固定化した保有する細胞（ 図2）【選択固定化生体触媒システムは、7サイクル後の最初のサイクルの変換収率の65％を維持し、良好な動作安定性を実証しました連続的な再使用、フリー電池システムは、ほぼ完全にその触媒活性を失っています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">LB broth&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022-6X1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Tris base</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7004-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Arabinitol</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3506-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Carbazole</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium alginate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Excella E24 shaker incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:200px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Beakers</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Syringe</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Needle</td>
			<td style="width:200px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td>
			<td style="width:200px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

我々は最近改善された生産収量と持続的な合成のための補因子再生と生体触媒の固定化の機能を備えた、シンプルな再利用可能と連結された全細胞生体触媒システムを開発しました。本明細書に記載さ2 E.から成るこのようなシステムの開発のための実験手順であります機能的に相補的な酵素を発現する大腸菌株 。一緒に、これらの二つの酵素はバイオ反応の生成物の収率を改善するため、高価な補因子の再生を仲介する協同機能することができます。また、アルギン酸カルシウムビーズ中の全細胞のカプセル化によって結合された生体触媒システムの固定化形態を合成する方法が報告されています。一例として、我々は、Eが結合することによって、L-アラビニトールからLキシルロースの改良された生合成を提示します大腸菌細胞が酵素のL-アラビニトール脱水素酵素やNADHオキシダーゼを発現しています。最適条件下で、150の初期濃度を用いmMのL-アラビニトール、最大Lキシルロース収率は、文献に報告されたものよりも高い96％に達しました。結合した全細胞生体触媒の固定化された形態は、遊離細胞系がほぼ完全に触媒活性を失っている間、連続した再使用の7サイクル後の最初のサイクルで得られた収率の65％を維持し、良好な動作安定性を示しました。したがって、ここで報告された方法は、L-キシルロースの工業生産だけでなく、一般的には補因子の使用を必要とする他の付加価値化合物の改善に役立つ可能性が2つの戦略を提供します。

補因子再生を有効にするには、L-キシルロース合成はE.を含む結合された全細胞生体触媒システムで行いました大腸菌 HjLADとE.コリ SpNox細胞 。様々なパラメータの最適化に続いて、このシステムの再利用は、アルギン酸カルシウムビーズ（ 図2）の中に固定化することにより改善されました。 <p class="jove...

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Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。

補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

immobilization-multi-biocatalysts-alginate-beads-for-cofactor

Research

JoVE Journal

Chemistry

17.2K ビュー.  Konkuk University. 提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。 

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

化学

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

凹面気孔率PDMSビーズのマイクロバブル作製

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O substrates outside vacuum at low temperature. The performance of photovoltaic devices featuring atmospherically fabricated ZnO/Cu2O heterojunction was dependent on the conditions of AP-SALD film deposition, namely, the substrate temperature and deposition time, as well as on the Cu2O substrate exposure to oxidizing agents prior to and during the ZnO deposition. Superficial Cu2O to CuO oxidation was identified as a limiting factor to heterojunction quality due to recombination at the ZnO/Cu2O interface. Optimization of AP-SALD conditions as well as keeping Cu2O away from air and moisture in order to minimize Cu2O surface oxidation led to improved device performance. A three-fold increase in the open-circuit voltage (up to 0.65 V) and a two-fold increase in the short-circuit current density produced solar cells with a record 2.2% power conversion efficiency (PCE). This PCE is the highest reported for a Zn1-xMgxO/Cu2O heterojunction formed outside vacuum, which highlights atmospheric pressure spatial ALD as a promising technique for inexpensive and scalable fabrication of Cu2O-based photovoltaics.

Improved Heterojunction Quality in Cu2O-based Solar Cells Through the Optimization of Atmospheric Pressure Spatial Atomic Layer Deposited Zn1-xMgxO

Here we present a protocol for synthesizing Zn1-xMgxO/Cu2O heterojunctions in open-air at low temperature via atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) of Zn1-xMgxO on cuprous oxide. Such high quality conformal metal oxides can be grown on a variety of substrates including plastics by this cheap and scalable method.

銅で改善されたヘテロ接合品質<sub&gt; 2</sub析出した大気圧空間原子層の最適化により&gt; O系太陽電池<br /&gt; Znの<sub&gt; 1-xの</sub&gt; Mgの<sub&gt; X</sub&gt; O

Atmospheric pressure spatial atomic layer deposition (AP-SALD) was used to deposit n-type ZnO and Zn1-xMgxO thin films onto p-type thermally oxidized Cu2O ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

金属有機性フレームワークの耐湿性を向上のための表面機能化

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a simple protocol for the multifunctional surface modification of NDs by using mussel-inspired polydopamine (PDA) coating. In addition, the functional layer of PDA on NDs could serve as a reducing agent to synthesize and stabilize metal nanoparticles. Dopamine (DA) can self-polymerize and spontaneously form PDA layers on ND surfaces if the NDs and dopamine are simply mixed together. The thickness of a PDA layer is controlled by varying the concentration of DA. A typical result shows that a thickness of ~5 to ~15 nm of the PDA layer can be reached by adding 50 to 100 &#181;g/mL of DA to 100 nm ND suspensions. Furthermore, the PDA-NDs are used as a substrate to reduce metal ions, such as Ag[(NH3)2]+, to silver nanoparticles (AgNPs). The sizes of the AgNPs rely on the initial concentrations of Ag[(NH3)2]+. Along with an increase in the concentration of Ag[(NH3)2]+, the number of NPs increases, as well as the diameters of the NPs. In summary, this study not only presents a facile method for modifying the surfaces of NDs with PDA, but also demonstrates the enhanced functionality of NDs by anchoring various species of interest (such as AgNPs) for advanced applications.

A facile protocol is presented to functionalize the surfaces of nanodiamonds with polydopamine.

ナノダイアモンドおよびその低減銀ナノ粒子の生体 Polydopamine 表面改質

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTMS. The deposition of APTMS and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

A protocol for the preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads is presented. The poly(PFPA) functionalized surface is then immobilized with antibodies and used successfully for the protein separation through immunoprecipitation.

蛋白質の浄化のため Poly(pentafluorophenyl acrylate) 機能 SiO2ビーズの準備

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...