このエクスビボモデルは、種々の生理学的介入ならびに薬理学的化合物ならびに筋肉グルコース取り込みの影響を評価するための有用な方法である。この技術は、無傷の動物モデルにおいて干渉し得る交絡因子の非存在下で、単離されたマウス骨格筋におけるグルコース取り込みの正確な評価を可能にする。実験を開始する前に、統合された筋ストリップバイオグラフシステムのスイッチを入れ、チャンバーを摂氏30度に温めます。
データ収集ソフトウェアを開き、強制トランスデューサを較正して、データセット間の比較可能性を確保します。予め加温した摂氏30度の基礎インキュベーション培地4ミリリットルを各インキュベーションチャンバに加え、培地が95%の酸素と5%の二酸化炭素で連続的に酸素化されていることを確認します。マウスを解剖トレイの臥位に置き、ペダル反射に反応しないことを確認します。
次に、1本の前足を針で固定します。はさみを使用して、アキレス腱と膝関節の両方が見えるまで下肢から皮膚を取り除きます。ヒラメ筋の解剖のために、16センチメートルの非吸収性外科用ナイロン縫合糸片から調製した直径0.4センチメートルの縫合ループを1本アキレス腱に取り付け、ピーン鉗子をアキレス腱の遠位に固定する。
ヒラメと腓腹筋を足から離すために切断し、マウスを横切ってピーン鉗子を慎重にスライドさせてヒラメの筋肉を露出させます。ピーン鉗子をピン留めし、ヒラメの近位腱の周りに2回目の縫合ループを置きます。近位腱を切断し、腓腹筋のない2つの取り付けられた縫合ループを含むヒラメを解剖する。
収集時に、ループを使用して、ヒラメ筋をインキュベーションチャンバの1つのそれぞれのフックにすばやく取り付けます。鉗子を使用して、脛骨前筋を覆う筋膜を除去します。脛骨前筋またはEDL筋の遠位腱は、透明で、目に見え、互いに分離しているべきである。
脛骨前筋の蒸留腱を切断し、筋肉を解剖する。鉗子を使用してEDL筋肉を周囲の組織から優しく解放し、腱を切断することなく筋肉をそのまま残します。蒸留および近位EDL腱の周りに個々の縫合ループを配置する。
ループが配置されたら、縫合ループを取り付けた状態で腱を切断してEDL筋を解放し、ループを第2インキュベーションチャンバ内のフックに素早く取り付けます。次に、各筋肉の安静時張力を約5ミリニュートンに調整し、実験を開始する前に筋肉が培地中で少なくとも10分間平衡化するようにします。インスリン刺激グルコース取り込みを測定するには、チャンバー内の基礎インキュベーション培地を、インスリンを含まないインキュベーション培地、最大以下の有効インスリン濃度、または最大有効インスリン濃度の20分間のインキュベーションと交換する。
刺激期間の終わりに、インキュベーション培地を、同一濃度のインスリンを含むグルコース取り込みインキュベーション培地と交換し、10分間インキュベーションする。グルコース取り込みインキュベーションの最後に、インキュベーションチャンバから筋肉を慎重に取り出し、氷冷基礎インキュベーション培地でサンプルを洗浄します。洗浄後、ろ紙の上で筋肉をすばやく乾燥させ、液体窒素中の縫合糸ループなしで組織を凍結する。
次いで、各チャンバーから100マイクロリットルのグルコース取り込みインキュベーション培地を収集し、摂氏20度貯蔵および筋肉グルコース取り込み分析を行う。収縮刺激されたグルコース取り込みを測定するには、インキュベーションチャンバ内の筋肉の中央および両側に白金電極を配置し、基礎インキュベーション培地をグルコース取り込みインキュベーション培地に交換した直後に筋肉収縮を開始する。インキュベートされた各筋肉からの強制生産を記録する。
10分後、実証したように筋肉を穏やかに収集および凍結し、実証されるように筋肉グルコース取り込み分析のために各チャンバーから100マイクロリットルのグルコース取り込みインキュベーション培地を貯蔵する。筋肉サンプルの同じセットにおけるウェスタンブロッティング分析によって筋細胞シグナル伝達を決定するために、各凍結筋肉サンプルを400マイクロリットルの氷冷ホモジナイズバッファーでホモジナイズし、サンプル端を摂氏4度で1時間回転させる。次いで、遠心分離によってリケートを収集し、標準的なウェスタンブロット分析プロトコルに従って、各サンプルパレット内の目的のタンパク質の量を測定する。
各サンプルにおけるグルコース取り込みを測定するために、各サンプルから150マイクロリットルの上清および対応するインキュベーションチャンバから25マイクロリットルのグルコース取り込みインキュベーション培地を加えて、バイアル当たり3ミリリットルの液体シンチレーション流体を含むバイアルを数える液体シンチレーションを分離する。次に、バイアルを液体シンチレーションカウンターにロードし、メーカーのガイドラインに従って2つのデオキシグルコースとマンニトールの放射能を測定します。この代表的な分析において、基礎グルコース取り込み速度は、雌マウスから単離されたヒラメ筋およびEDL筋肉間で類似していた。
ヒラメおよびEDL筋肉におけるグルコース取り込みは、サブ最大および最大有効インスリン濃度の両方に応答して増加した。さらに、最大以下および最大インスリン刺激グルコース取り込みの両方がヒラメ筋において有意に高かった。対照的に、収縮誘導グルコース取り込みは、ヒラメ筋と比較してEDLにおいて有意に高かった。
ここで、10分間の刺激期間中にヒラメ筋およびEDL筋に生じる最大筋力が観察され得る。予想通り、EDL筋は刺激期間の初期により多くの力を生成し、その後、刺激期間の後半に急速に減少した。最大以下および最大インスリン濃度は、Aktスレオニン308およびTBC1D4セリン588のリン酸化の増加を誘導し、一方、収縮はAMPKアルファスレオニン172およびACCセリン212のリン酸化の増加を誘導した。
インスリンも収縮も総タンパク質含有量の変化をもたらさなかった。単離されたマウスの筋肉におけるグルコース取り込みを測定しようとする前に、ヒラメおよびEDL筋肉の解剖を徹底的に実践することが不可欠である。筋肉グルコース取り込みの評価に続いて、残りの筋肉タンパク質溶解物を、グルコース取り込み速度の観察された変化を解明し得る追加の生化学的分析に使用することができる。
