The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

注：この論文で説明されているすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立されたガイドラインに従って実施されている。 1.システム準備とセットアップ<ol><li> 50ミリリットル組織浴に使い切る組織浴収縮実験に必要な量である生理食塩水（PSS）の5 Lを作る。 PSSレシピについては、表2を参照してください。組織浴時間風呂のボリュームの数を乗じた後、必要な組織洗浄の回数を掛けることによって、総必要容量を計算します。 <ol><li> PSSを作るためのガイドとして、表2を使用してください。水の約4リットルに塩を溶解。注：HPLC - タイプIの水が推奨されます</li><li>エンド·ソリューションは、1.6 mMのカルシウムであるので、この溶液に（二水塩を使用している場合147グラム/ L）1 M CaCl 2溶液の8ミリリットルを追加します。 </li><li> 5 Lに量子sufficit PSS溶液</li></OL&gt; </li><li>再循環加熱した水浴をオンにして37℃に組織浴システムを予熱する。重要なステップ：システムの各構成要素は、それらが互いに直列に接続されていることを確認し、水ジャケットである。流れの方向は非常に重要です - 水が最高有刺鉄線接続で最低の有刺鉄線の接続に出入り各コンポーネントに流れ込むことを確認してください。 </li><li>データ収集システムの電源をオンにします。温度を平衡化するための実験の前に少なくとも力変換器の電源をオンにし、15分。 注：ほとんどの力変換器は、温度の変化に敏感である歪みゲージを採用し、電源投入後、最初に熱ドリフトを示す。 </li><li>発射データ収集ソフトウェアおよびデータ収集システムとの接続を確保する。データの記録を可能にするための製造指示に従ってください。 </li><li>力変換器は、組織が組織浴中に、データ記録が開始されたの前に配置される前に校正されていることを確認してください。 FOキャリブレーションのための製造業者の指示LLOW。 </li><li> 95％O 2/5％CO 2医療グレードのガスボンベに組織浴システムを接続し、ガス漏れをチェックしてから、システムを加圧する。 </li><li> PSSで組織浴のリザーバを記入し、解析時間が最適な温度に到達することができます。プライムシステムとシステムとチューブ内の気泡を除去する。 </li><li> PSSバッファを含酸素化合物と実験中に組織浴中に導入される薬を配布するためにブラウン運動を提供一貫性のあるソリューションの通気を確保するために組織浴エアレーターを確認してください。曝気/気泡がデータの記録が中断され、組織の動きを、発生しないことを確認してください。必要に応じてガス流を減少させる。 注：組織浴とデータ収集システムは現在、実験を開始する準備が整いました。 </li></ol> 2.組織の準備<ol><li>理想的には、私を使用して直接配置する直前に動物からの組織を解剖PSS Ntoを。 注：一部の組織は、4℃で一晩PSSに保存することができますが、適切なコントロールは、長期保存後の組織機能を検証するために行われなければならない。第6節を参照してください。 </li><li>この演習で組織として胸部大動脈を使用してください。 </li><li>施設のガイドラインに従って、ラットを麻酔し、ラットの背側を下に置きます。つま先ピンチとこの痛みを伴う刺激に対する反射応答の損失を経由して麻酔を確認してください。 注：このプロトコルは、腹腔内注射によって送達ペントバルビタールの70 mg / kgをを使用しています。齧歯類麻酔のための制度のガイドラインが異なる場合があります。 </li><li>胸郭の下部にダイアフラムに沿ってハサミで切開を作成することにより、気胸を作成します。次に、胸骨に胸郭の底部から切開を継続し、二分。 </li><li>離れて解剖や脊柱の上にあるそれらの臓器を脇に置き、脊柱に沿って直接位置する大動脈を、見つける。 注：このは、STEPは、大動脈を切開する明確な作業スペースを提供しています。 </li><li>大動脈へのすべての接続を切断。食道、肺、などから、振動板のレベルで脊椎に垂直な大動脈を切った。 </li><li>静かに鉗子で大動脈を保持し、背骨から大動脈を切開するはさみを使用しています。心臓に向かって背骨と仕事に隣接する下部振動板面積で解剖を開始します。組織が損傷することがあり大動脈組織、引っ張ったり綱引きしないように余分な予防策を取るようにしてください。 </li><li>すぐにPSSを含む準備された解剖皿に大動脈を置く。 注：リングに大動脈の解剖が最高の黒シラスティック基盤を持って、解剖皿に行われます。これは、解剖皿内ながら安定性を提供し、大動脈にカニューレを挿入するために用いることができ、皿に固定されるワイヤの使用を可能にする。黒の背景には、解剖を補助するコントラストを提供します。ケアは、内皮としてカニュレーションのワイヤの使用に注意が必要ですIAL細胞層は血管の内腔に対するワイヤの過剰なラビングを用いて除去することができる。 </li><li>ワイヤーを取り、一方の端に小さな90°の角度を作り、ガイドワイヤを固定するシラスティック基盤に角度付きの端を押してください。解剖皿に全体の大動脈を置きます。 </li><li>ピンセットで、ガイドワイヤの端を持ち、ゆっくり大動脈の内腔にワイヤーを通します。 </li><li>鉗子を使用して、ワイヤ上に大動脈をスライドさせます。ガイドワイヤの自由端を穏やかに湾曲ワイヤ、表示され、組織を安定化するために皿のシラスティックファンデーションに自由端を配置する。 </li><li>胸部大動脈は、白とやや繊維質表示されるまで、小さなvannasハサミやピンセットを使用して、血管周囲脂肪組織および他のすべての余分な組織、血の塊などを削除します。 </li><li>ワイヤからきれいに大動脈を取り出し、幅約3〜5ミリメ​​ートルである環中の大動脈をカットするはさみを使用しています。 </li><li> tiの対の一方に大動脈輪を配置フックを保持し、静かにフックの上にリングをスライドさせる鉗子を使用して、ssueフック。第2フックと、このプロセスを繰り返します。フックがもつれないように注意してください。 図3を参照してください。 </li><li>各フックは付属の異なる絹縫合糸を持っていることを確認してください。他は手で結ば力変換器になります10〜4センチメートルロングピース縫合糸である、一方のフックは、ガラスやステンレス製の棒への取り付けが可能に絹の小さな結び目ループを持っていることを確認してください。 図3を参照してください。 NOTE：大動脈をフックに固定されると、組織は組織浴に装着する準備ができている。 図3を参照してください。 </li><li>繰り返しは、第二組織浴室において第二大動脈リングをマウントするために、2.14から2.15繰り返します。 </li></ol>バースの3組織の配置<ol><li>このシステムでは、組織浴自体が静止していることに注意してください。この時、温め、曝気PSSで組織浴を記入し、溶液がtemperaturに来てできるようにするE。 </li><li>絹縫合糸で、ステンレス鋼ロッドにペグに組織標本上のフックの1つを結びつける。組織浴室にこのエンドを置きます。リングスタンドにロッドを接続し、バッファに浸漬組織を維持するために、PSSで満たされた染色皿の中もう一方の端を置く。 図3を参照してください。 <ol><li>組織浴室においてロッドと組織を置き、組織が完全にPSSに浸漬され、ロッドが安全であることを確認してください。 図3を参照してください。 </li><li>力変換器に他の縫合糸を結ぶと組織と力変換器との間に縫合糸のたるみを残すようにしてください。 注：このたるみは、マイクロメータを調整することにより、削除されます。 図3を参照してください。 </li></ol></li><li>第二大動脈リングと組織浴室のためのこれらの手順を繰り返します。 </li></ol> 4.パッシブテンションを設定する注：各組織は、平滑筋細胞は最適値に応答する時の長さ（ロー）を有するLLY。予備実験は、個々の組織タイプのために実行する必要があり、この長さは、検査されるべき実現する最適な延伸張力を決定する。ラット胸部大動脈は4グラムの最適な受動的なストレッチのテンションを持っています。 <ol><li> 2グラムに張力を高め、プラトーに到達するために組織を待つためにマイクロメータ/ラック＆ピニオンを使用してください。高原に達すると、テンションに別の2グラムを高め、高原に組織を待つ。 注：2グラムの初期張力が設定され、プラトーに達した後、大動脈輪では、組織はその後〜1.6グラムに緩和すべきである。 2グラムの第2の適用は、組織が再びリラックスし、緊張が低下しているから〜3.6グラム、に組織をもたらすだろう。従って、トータルテンションを4g加えた後、ソフトウェアは、張力の約3.2グラムを示すべきである。 </li><li>第二大動脈リングと組織浴室のためのこれらの手順を繰り返します。 </li></ol> 5.平衡医薬品メイキング<ol><li>のための組織を平衡化する組織への受動的な張力を付与した後60分。 </li><li>平衡相の間に、組織ごとに15〜20分洗浄する。組織槽を排出し、温め容器からPSSにPSSを交換してください。 注：この時間の間に、組織は、受動的な緊張の喪失によって示されている、リラックスします。 </li><li>この時間の間、そのように薬剤ストックのごく容積が所望の濃度を達成するために必要とされ、浴中の実際の濃度よりも少なくとも1,000倍より濃縮する必要が実験のための薬剤を調製する。 </li></ol> 6.最初のチャレンジ<ol><li>平衡期間の終わりに、組織を最後に1回洗浄し、データを保存し、再ゼロすべての入力。 </li><li>組織が応答する（アクティブ収縮の原因となる化合物）アゴニストを選択してください。 注：ラット胸部大動脈では、動脈平滑筋を積極的に原因の神経支配にαアドレナリン受容体作動薬に収縮する交感神経系による組織。アドレナリン作動薬は、アドレナリン作動薬が弛緩を引き起こすことを考えると、腸組織において有用ではない。この場合には、アセチルコリン（コリン作動性受容体）などの受容体アゴニストを使用することができる。フェニレフリンおよびアセチルコリン両方の代替は、第1のチャレンジなどの高カリウム（K）などの非受容体アゴニストを使用することである。平滑筋では、高K間接的オープンカルシウムチャネルに動作し、したがって、平滑筋の完全性の一般的な指標と見なされる。 <ol><li>組織浴に10 -5 Mのフェニレフリンを追加することによって、最初の課題やウェイクアップ挑戦を実行します。 50ミリリットルの組織浴にこの濃度を達成するために、10 -2 Mのフェニレフリン溶液50μlを加える。 注：PSSの50ミリリットルに50μlを1 / 1,000に希釈され、最終的な濃度が1,000倍株式未満、または10 -5 Mである組織浴C内のボリュームとボリュームの一貫性の維持管理の知識hamberは、最終薬物濃度を決定するために重要である。 </li></ol></li><li>データの勾配がゼロになったときに、組織浴に10 -5 Mのフェニレフリンを追加し、ピーク収縮を可能にし、その後プラトー。ポスト実験解析を支援するために、各実験イベントを記録するようにしてください。 </li><li>高原の後、新しいPSSと組織浴室を空にして再充填することによって徹底的に作動薬を洗い流す。同様にこれらのイベントを記録するようにしてください。 注：経験則は、浴中のアゴニストの濃度は、各洗浄で10倍に減少することである。なお、以上の3〜4回の洗浄が戻ってダウンしてその平衡ベースライントーン（テンション）に組織を持参する必要があるかもしれない。 </li><li>先に進む前に〜10分間のベースラインのトーンでの組織残りをしましょう​​。 </li></ol> 7.実験 NOTE：プラゾシン、αアドレナリン受容体アンタゴニストは、濃度応答受信シフトする組織浴室に導入されるオンセ曲線フェニレフリン（PE）へ。これは明白な拮抗作用である。 <ol><li> 1バスに、プラゾシンを溶解したビヒクル（H 2 O）を添加する。別に、プラゾシンの適切な濃度を追加します。この例では、5×10 -9 Mまたはバスで5 nMの濃度を達成するために、他に1バス、プラゾシンの10 -5 Mの濃度の25μlに車両の25μlを添加する。 注記：車両の添加は、この例では、不要と思われる一方で血管作用である可能性がある他の車両使用時に、そうすることが必須である（ 例えば、DMSO、エタノール、酢酸塩）。それは血管作動性であるために少し証拠が存在する場合でも対応する車両を追加します。 </li><li>浴中の車両/プラゾシンのままにして、1時間のために組織を洗っていません。 <ol><li>組織が平衡化されていますが、作動薬（PE）の複数の濃度を準備。 例えば、&lt;応答を誘発しない濃度（より広い範囲の濃度を含む/ em&gt;の10 -9 M PE）最大応答（ 例えば、10 -4 M PE）を上回る濃度に。濃度-応答曲線は自然対数であるため、10 -1 Mのストック溶液から連続希釈を介してPE（10 -6〜10 -1 M）の6つの別々のストック溶液を作る。各濃度のために必要なボリュームがすべて風呂（ すなわち &gt; 300μl）をするために必要なトリプル総量よりも若干大きくなっていることを確認します。 </li></ol></li><li> 表1に記載されるように、作動薬の追加に進みます。 注：この実験は、PEに累積濃度応答曲線を生成します。各反復は、物質の量は、既に浴に添加考慮する。彼らはもはや収縮を増やす、または全体の曲線がプラトーするまで追加は発生しません。 <ol><li>組織のしきい値に達するまで、個別に各薬物濃度を追加する。 </li><li>変化が発生しない場合、次の濃度を追加シリーズ; 表2を参照してください。 注：これらの追加のタイミングが使用される作動薬に依存します。例えば、ノルエピネフリンおよびフェニレフリン収縮が急速に発達し、数分以内にプラトー必要があります。これとは対照的に、エンドセリン-1収縮はゆっくり開発し、近くに45分間プラトーない場合があります。他の実験限り、このような曲線の構築後の組織で行うことができる（1）物質の洗浄うち。 （2）それは、組織が正常な収縮挙動に戻り、以前の刺激に影響されないことを実証することができる。 </li></ol></li></ol> 8.データ解析<ol><li>前と介入後すぐにデータを保存してください（ 例えば、ウェイクアップまたはフル曲線）。 </li><li>検索してデータ分析を支援する各組織浴室/入力チャネル、のための組織ベースラインを設定。 </li><li>ベースラインが設定されると、各濃度について最大応答を見つけ、ちゃんを記録ベースラインからのGE。順次濃度のそれぞれを通って移動し、ベースラインシフトを記録。 </li><li>得られたデータをグラフ。すべてのグラフのプログラムでこれを行います。 注：グラフパッドプリズムは薬理学者のために設計され、これはここに提示され、実験のタイプに最適です。 </li></ol>

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M., O'Connor, C., McLoughlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+changes+in+pH+on+wall+tension+in+isolated+rat+pulmonary+artery:+role+of+the+RhoA/Rho-kinase+pathway.">Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).</li><li>Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+are+uncoupled+from+contraction+in+rat+vena+cava.">Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava.</a> Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

研究ツールとしてアイソメトリック力の測定は、150年以上の歴史ですが、それは収縮組織2における受容体の特徴付けのためのプロトタイプ的な技術であり続けている。この技術のパワーは、その単純さと汎用性である：アンタゴニストの存在下または非存在下でのアゴニストの濃度を増加させることにより誘発応答を記録することによって、情報の無数の各薬剤の薬理学的特徴との受容体について導出することができるそれは3-5にバインドします。このタイプの実験を使用してもアンタゴニストの非競合的性質に対する競争力、ならびに受容体の不均一性および非特異的薬剤効果6-8についての情報を集める。したがって、この単離された組織浴実験の簡単な順列で、アゴニスト誘導性の筋収縮を媒介する受容体の比較的完全な薬理学的プロフィールを生成することができる。 作動作用の面では、目所定の組織におけるアゴニストの電子相対効力（E MAX）及び効力（EC 50）を計算し、同じ組織1内の他のアゴニストの応答と比較することができる。我々の実験では、ラット胸部大動脈は、車両または組織浴にα1アドレナリン作動薬のフェニレフリンを添加し、収縮を生成する前に、1時間のためのα1アドレナリン受容体アンタゴニストプラゾシン（5 nM）のいずれかと共にインキュベートした。2プレゼント修正された結果を図図1の。緑の応答は、PEによって達成される最大収縮にマークされている最大、などして、その応答を引き起こしたPE濃度に関連したとしてマーク½最大収縮としてマーク。これらの値を特定する半最大（50％）応答またはEC 50値を達成するアゴニストの有効濃度を識別している。 残念ながら、アゴニスト依存パラメータを使用して、受容体結合特性が9を複雑になることが決定するために、一人でね。アンタゴニスト解離定数（pK aはB）の-log 10モルアンタゴニストの-log 10：理想的には、レセプターアンタゴニストを使用する追加の実験は、薬物と受容体との間の相互作用を定義するための鍵である2つの重要なパラメータの計算を可能にする濃度-応答曲線（pAの2）10の2倍の右方向シフトを誘発するのに必要な濃度。 K BとのpA 2ゲインそれらはアゴニスト独立した値であり、さらに異なる組織11との間で一定のままであることから、その有用性の両方。 図2のデータから、pK aはBは以下の式を用いて計算することができ、他の場所で計算されたEC 50値に基づく。 プラゾシン= 2×10 -8 Mの非存在下でのEC 50 前でのEC 50プラゾシンのSENCE = 7×10 -6 M 次式でK Bについて解く： ログイン（DR-1）= [B]ログ- K Bを記録 ここで： [B] =アンタゴニストの濃度は、5×10 -9 M.ログ（5×10 -9 M）= -8.3 DR =非存在下での拮抗薬/ EC 50の存在下でのEC 50値の用量比。右方向へのシフトがある場合、この値は1よりも大きくなる。このように： ドクター= 7×10 -6 M / 2×10 -8 Mまたは700×10 -8 M / 2×10 -8 M = 2分の700 = 350 [B]とDRのために代入すると： （350-1）のログ= -8 -ログK B 2.54 = -8 - KBを記録 のpK B = 10.54 プラゾシンのこの値は、プラゾシンは、α1アドレナリンRECEPTと対話するときに得られた値と一致しているフェニレフリンに収縮を仲介するアドレナリン受容体は、α1アドレナリン受容体であることを示唆または12,13、。 いくつかのステップは、これらの実験の成功に不可欠である。組織は、組織の生存率の低下を防ぐために、解剖後にPSSに残る必要があります。任意の等角筋標本は、受動張力14,15に対して最大の力を発生させる最適な長さ-張力の関係を有する。このプロトコルに記載した実験のために、最適な受動的張力が以前に簡単に組織への受動的張力を0.5gずつを加算することによって決定した。組織は、トーンなしで始まるべきであり、その後、平衡の30分後、組織を活性のトーンを生成したKClを最大濃度（80 mM）を、でチャレンジした。次に、組織を洗浄し、ベースライントーンに戻した。ベースラインで15分後、受動的張力の別の0.5gを入れ、このプロセスのプラトーまで繰り返すアクティブテンションが追加の受動的なテンションで達成された。予備実験では、受動的な張力の4gの合計は、大動脈環に最大活動張力の発生を達成するために決定されたので、テンションのこの総量は、前平衡にリング上に配置される。手続き的に、それは前に受動張力付与をゼロにするのがベストですが、実験前にいつでも行うことができます。過ストレッチ組織、実験や解剖の任意の時点で、否定的に組織の生存と実験の成果に影響を与えます。このステップは、過剰なストレッチの最も尤度を持つように、浴中に組織を配置する際にこれが最も肝要である。数と期間における適切な洗浄は、再現性の効果のために必要とされる。第二の課題は、あまりにも早く組織がベースラインテンションに戻ってきた最初のチャレンジの後、または前に、異常な応答になります。可逆拮抗薬/阻害剤を研究した場合、組織はinhibiとして、さらに、アゴニストの前に洗浄されるべきではないター濃度が低下する。 孤立した組織浴アッセイに注目すべき長所と短所があります。 短所：組織は、フック上のリングの外科的除去または配置時の損傷の程度が異なることがあります。内皮細胞は、大動脈リングの内側のライニングであるため、この細胞層を損傷しないように、注意がフック上のリングの配置に注意する必要があります。組織はまた、組織浴中で生存可能である、時間の明らかに異なる長さを有していてもよく、これは、決定されなければならない。ていないすべての組織が同じである。この線に沿って、組織がタイムコントロールは、すべての実験のために必要な制御になるように一日を通して彼らの応答性に変更されることがあります。この良い例が、一般的な8時間の実験中に100パーセントによって収縮最大に向上させたモルモット気管です。水に難溶性である薬物は、PSSに析出することができる。最後に、累積ANDアゴニストに対する受容体脱感作が発生した場合、アゴニストは異なる結果になる可能性がある薬剤の非累積加算。アンジオテンシンIIは、迅速なタキフィラキシーを示しているそのような薬剤である。 利点：組織浴実験の主な利点の1つは、リアルタイムであることである。一つは、それが繰り広げられると急速に結論と計画の次のステップを作ることができるように実験を参照してくださいだけでなく、実験中にトラブルシューティングを行うことができます。実験を行うのは一日かかります。複数の組織は、典型的には、動物自身の対照としての役割を果たすことができるように、1つの動物から調製することができ、それは、実験に強度を付加する。薬剤に対する組織の比較的純粋な応答を試験するように、一つは、他の要因から組織を単離することができる。そのような組織浴システムのようなインビトロ実験はまた、 インビボでの実験と比較して、少量の薬物の使用を可能にする。 ここに説明した基本的な実験計画をすることができます広範囲に追加のパラメータの記録または他の外部刺激の導入を可能にするように変更。例えば、電極の添加は、神経支配する神経16,17の電場刺激を可能にする。熱またはpHプローブを添加して、収縮反応に対する温度及びpHの効果も18,19を計測することができる。同様に、酸素は、低酸素症誘発性効果を評価するためにN 2で部分的にまたは完全に置換することができる。また、このビデオで使用される等尺収縮性測定の同じ基本的な原理は、等尺性張力の発生および細胞内カルシウム20の変化の同時測定を可能にするシステムを開発するために使用することができる。システムは、それが迅速に応答中に組織試料を凍結すること存在するため、シグナル伝達はまた、容易に、研究され、シグナル伝達経路系の活性を生化学的に検証することができるようになっている。 EQUのバリエーションこれを行うために使用することができipmentは膨大である。このシステム全体を構築または自動のどちらか一方は、複数の異なる企業から購入することができる。このプロトコルで使用される組織浴および組織ホルダーは、社内のミシガン州立大学の機械工場によって手吹き（組織浴）と手を構築（保有者）であった。

薬理学の規律は、150年以上にわたって孤立した組織浴システムを使用しています。このシステムの汎用性は、高血圧、心不全、糖尿病、胃腸疾患、膀胱のような疾患または障害を有する個体の数百万を扱った治療法の基礎を形成し、この知識を、受容体および受容体シグナル伝達を特徴づけるために、世界中の科学者を可能にした機能障害、喘息、および嚥下障害、わずか数名に。それは組織が組織として機能することを可能にするようにこの日に、孤立した組織浴は、医薬品開発や基礎研究の重要な側面のまま。このJoveのレッスンでは、正式なプロトコルは、受容体の特徴付けを可能とする等尺性収縮を測定孤立した組織浴実験からのデータを利用して視覚と仮想実験を実証するために共有されている。 この技術の主な利点は、組織が生きていることである身体に関連する生理的な結果（収縮または弛緩）との全組織としてND機能し、。なお、ステップ（薬物 - 受容体相互作用、シグナル伝達、セカンドメッセンジャーの生成、平滑筋の興奮性の変化、および組織機能の変化）の合成である。他の技術は、これらの各手順の検討（薬物親和性のバインディング例えば放射性リガンド、セカンドメッセンジャーの測定）を可能にしているが、孤立した組織浴技術は、すべてのこれらのステップ1の統合が可能になります。もう一つの利点は、組織機能を保持する細胞の設定VS組織において、より意味のある重要な薬理学的変数の計算を可能にするということです。それは、検査薬は全体として体内でどのように動作するかに近づく。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

アゴニズムの観点から、相対的な有効性（E MAX）と所定の組織におけるアゴニストの効力（EC 50）を計算し、同じ組織1内の他のアゴニストの応答と比較することができる。我々の実験では、ラット胸部大動脈は、車両またはその前（ 図1）を組織浴にα1アドレナリン作動薬のフェニレフリンを添加し、収縮を生成する一時間α1アドレナリン受容体アンタゴニストプラゾシン（5 nM）のいずれかと共にインキュベートした。 図2のプレゼントは、 図1の結果を変更しました。緑の応答がPEによって達成される最大収縮が最大、などして、その応答を引き起こしたPE濃度に関連したとしてマーク½最大収縮としてマークマークしている。これらの値を特定する半最大（50％）またはEC応答を達成するアゴニストの有効濃度を識別している<s&gt; 50値UB。これはdonegraphicallyシグモイド曲線についてロジスティック関数を使用してこのexample.ComputerソフトウェアでカーブフィッティングおよびEC 50値の計算のために使用することができた。 生成して、これらの結果を解釈するには、濃度 - 応答曲線を作成するためにアゴニストの両方の低濃度および高濃度を使用することが重要である。安定なベースラインと最大プラトーを示すために十分なポイントがない場合、EC 50及びE MAXのみを推定することができる。これは、この例では、グラフィカルに行われた。シグモイド曲線についてロジスティック関数を使用しているコンピュータソフトウェアは、カーブフィッティングおよびEC 50値の計算のために使用することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> 図1：二重壁に配置された組織のリングを表す組織バース回路図漫画、水ジャケット組織BA目。バッファの流入および流出は、チャンバの底部に一体化三方ガラスコックによって調節される。 O 2 / CO 2は、PSSやガスの漏れを防止するためのガスケットで封止されているエアレーターを通してバブリングされる。再循環入力が適切な循環を維持し、温度調節不全を引き起こす空気ポケットの形成を防止するために、出力を下回っている。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> 図2：ラット胸部大動脈+内皮は、上の図は、4つの別々の実験（異なる動物と異なる色で表されるように異なるセットアップ上の別の研究者によって行われます）PE誘発収縮をシフトするプラゾシンの能力をテストすることを示している。プラゾシン（5 nM）を明確に並列にPE誘発収縮曲線を右方向にシフトした。 図3：ラット胸部大動脈+内皮グラフィカル不在（車両）におけるPEのEC 50値の推定とアンタゴニストの存在（プラゾシン）。。グリーンライン（グループC）は、唯一のマークされます。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> ソルト </td><td> MW（G /モル） </td><td> 5リットル </td><td> FINAL mMの </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> （グラム） </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム•7H20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td> 84.21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td>ブドウ糖</td><td> 180.16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> 表1：正常な生理的塩溶液（PSS）レシピ本実験で用いた重炭酸塩緩衝化PSSの内容。。全ての塩の分子量および所望の濃度を達成するためのdH 2 Oを5 Lの添加量も含まれる。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> お風呂での濃縮 </td><td> アゴニストの添加は風呂に加えられた </td></tr><tr><td> 1×10 -9 M </td><td> 50ミリリットル1×10 -6 M </td></tr><tr><td> 3×10 -9 M </td><td> 100ミリリットル1×10-6 M </td></tr><tr><td> 1×10 -8 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -5 M </td></tr><tr><td> 3×10 -8 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -5 </td></tr><tr><td> 1×10 -7 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -4 M </td></tr><tr><td> 3×10 -7 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -4 M </td></tr><tr><td> 1×10 -6 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -3 M </td></tr><tr><td> 3×10 -6 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -3 M </td></tr><tr><td> 1×10 -5 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -2 M </td></tr><tr><td> 3×10 -5 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -2 M </td></tr><tr><td> 1×10 -4 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -1 M </td></tr></tbody></table> 表2：組織バース添加アゴニスト濃度プロ各浴に添加されるアゴニストの量。perly累積濃度 - 応答曲線を構築する。所望の浴濃度は、アゴニストの漸増濃度の連続的な量を添加することによって達成される。各添加を考慮にバス内にすでに存在するアゴニストの濃度を取ります。これは、アゴニストの単一濃度の増加ボリュームを使用することから生じるであろう組織浴中の体積の増加を最小限にするために行われる。

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

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Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

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135.8K ビュー.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

ビデオ: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

生物学

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

マウス単離された灌流腎臓テクニック

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...