様々な牛の脳構造における狂犬病ウイルスの定量化メキシコは家畜の可能性が高い国です。家畜生産量が最も高い州には、吸血鬼のコウモリ、狂犬病の主な送信機であるDesmodus rotundusの存在により狂犬病の流行の危険にさらされている湿気の多い熱帯地域と乾燥した地域の両方が含まれています。
狂犬病ウイルスの検出は、ヌクレオプロテインN遺伝子が主に分子検査による狂犬病診断に用いられる。PCRベースのアプローチを使用すると、DNAヌクレオチド配列の選択的および反復増幅を通じて、臨床サンプルで感染因子の最小量を検出することができます。qRT-PCR は、蛍光シグナルが増加する分子の検出と定量が、単一の反応における PCR 産物の量に直接比例して行われているものに基づいています。
核酸標的のコピー数が増加するにつれて、蛍光も増加する。これに基づいて、研究の目的は、狂犬病感染による死亡後、牛の脳の異なる解剖学的構造におけるウイルス粒子の数を決定するために定量qRT-PCRを使用することであった。総RNAは、以下のプロトコルに従って有機抽出法を用いてウシの脳から直接抽出した。
各解剖学的構造から100ミリグラムの脳組織を使用して、グアニジニウムイソチオシアネートを含む市販の試薬を使用して全RNAを抽出する。グアニジニウムイソチオシアネート試薬の1ミリリットルの各構造から、最大速度で15秒間、マイクロチューブ内に小さな害虫を持つDounceホモジナイザーを使用してボルテックスすることにより、各構造から合計100ミリグラムの組織を手動で均質化する。サンプルを氷の上で5分間インキュベートし、200マイクロリットルのクロロホルムを加えます。
サンプルを15秒間激しく混ぜます。氷の上で2〜3分間インキュベートし、12,000 x gで遠心分離機を摂氏4度で15分間インキュベートします。水相をきれいなチューブに移し、500マイクロリットルのイソプロピルアルコールを加えます。
サンプルを摂氏21度で15分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度で10分間10分間遠心分離する。ピペット処理により水性上清を吸引する。
単離されたRNAは、チューブ内にペレットとして存在する。次に、75%エタノールの1ミリリットルでRNAペレットを7、500 x gの摂氏4度で5分間遠心分離機で洗浄します。上清をデカントし、空気は室温、摂氏21度でRNAペレットを乾燥させます。
次に、50マイクロリットルのヌクレアーゼを含まない水でペレットを希釈します。分光光度計を用いて260ナノメートルでRNA濃度と品質を決定します。インビトロ転写は、標的遺伝子のmRNAを生成する。
完全なRABV N遺伝子を増幅するプライマーペアと、qRT-PCRアッセイの陽性対照として使用されるプライマーペアを使用してください。これらのプライマーは、完全なRABV N遺伝子を増幅し、T7ポリメラーゼを認識するプロモーターを添加するように設計されている。N遺伝子RABV全体を増幅するには、プライマートランスとRABフォワードとリバース、および高忠実度PCRキットを使用してください。
各反応に対して、各プライマーの10マイクロモルと0.5単位の高忠実度ポリメラーゼを用いたクリーンなPCRチューブ反応バッファーに添加して、PCRマスターミックスを調製します。インビトロ合成のテンプレートとして PCR 製品を使用し、酵素反応の成分を除去するには、メーカーの指示に従って、カラムベースの濃縮キットを使用して PCR 製品を精製します。そして、分光光度計を用いて定量化する。
RNA合成には、インビトロ転写キットを使用し、次の反応混合物を用いて、5マイクロリットルT7転写5Xバッファー、各三リン酸ヌクレオチドの1.9マイクロリットル、精製RABV N DNAの10マイクログラム、および2.5マイクロリットルの酵素混合物を使用する。次に、摂氏37度で4時間培養する。次に、反応混合物にマイクログラムRnase-Free DNaseあたり1単位の1マイクロリットルを加え、37度で15分間インキュベートしてDNA汚染を排除します。
インビトロ転写RNAを精製し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを25:24:1の比率で濃縮します。精製したRNAペレットを70マイクロリットルのTEバッファーに再懸濁し、使用するまで摂氏80度で保存します。PCR プロミコールを、約 5 マイクログラムの PCR 産物が得られるまで繰り返します。
精製および濃縮後、インビトロ転写されたN遺伝子mRNAは、マイクロリットル当たり4.711マイクログラムの濃度で存在する。in vitro転写されたmRNAがこのプロトコルのステップ5に続くN遺伝子に対応していることを確認し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、qRT-PCRの陽性対照として使用する。リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のために、完全なN遺伝子を陽性対照としてコーディングする際にin vitro mRNA転写物を使用する。
市販のワンステップqRT-PCRキットとともに、メーカーの指示に従ってハイブリダイゼーションプローブを使用。コロナドおよび同僚2010によって記述されたプライマーのプローブを使用して、以下の熱循環条件を用いてRABVの保存領域を検出する。6つの分離希釈が得られるまで、mRNAのマイクロリットル当たり1マイクログラムをチューブに連続的にピペット処理することによって、インビトロ転写mRNAの連続希釈を行う。
標準曲線の作成に使用するために、3重で100マイクロリットルの体積でチューブを準備します。前述のとおり、qRT-PCR を実行します。ローターを使用して、さまざまな脳サンプルを実行反応と同時に処理して、標準曲線を作成し、細胞培養から分離された正のコントロール、陰性コントロール、上清を使用して、ローターを使用してqRT-PCRを実行します。
試験の検出限界、試験効果、感度を評価するには、同じ条件で三重化の標準曲線を使用します。RABV遺伝子Nの検出には、上記のPCRキットを使用してqRT-PCRを実行するために、フィールドサンプル、陽性対照、陰性対照、および細胞培養上清からのRNAを使用します。ウシの脳サンプルに存在するRABVゲノムのコピー数を決定するために、標準曲線および生体試料からCTデータを取得し、そして検量曲線式から補間されたものから、この図は、直接免疫蛍光に従って陽性染色を示す牛の脳組織を示す。
結果は、皮質、視床、髄質、ポン、および角におけるRABVの100%100%83.3%66%および50%陽性を示す。これらの結果は、前の結果を確認し、各脳から解剖した少なくとも3つの構造がRABVに陽性であった。一方、標準曲線の式は、サンプル中のRABV遺伝的含有量の量とPCR増幅断片のサイズとの関係を示す。
ナノグラム中のRABV遺伝的含有量の量は、この図に示した式を用いて較正曲線中のCT値の補間によって推定された。この式を用いて、ウイルスRNAのマイクロリットル当たり10倍から5マイクログラムの検出限界がRABVゲノムの36コピーに相当することを発見した。これらの結果は、アッセイが感受性であり、RABV N遺伝子のコピー数が少ないサンプル中のウイルスを検出するために使用できることを示しています。
アッセイの効率は、標準曲線の傾きを用いて計算した。これは3.28であった。qRT-PCRに使用したサンプルは、RABV N遺伝子の増幅を示した。存在するウイルスコピーの数を決定するために、各サンプルのCT値を、較正曲線式を用いて補間した。
ナノグラムで得られた結果を、ここで説明する式に置換した。次の表は、qRT-PCR と DFA の比較結果を示しています。qRT-PCRアッセイの結果はDFAを用いて得られたものと一致した。
CおよびDの場合におけるqRT-PCR試験で得られた結果によると、視床はRABV N遺伝子のコピー数が最も多い構造である。これは、これらのニューロンが動物の栄養機能を制御することを考えると、視床下部および視床神経の早期感染が疾患の発症に重要であることを示唆している。各サンプルの各構造で検出されたRABV N遺伝子のコピー数は、すべてのサンプルが陽性であったため、qRT-PCR試験の感度と特異性が100%です。
この結果は、サンプルの初期診断と一致します。qRT-PCR は高感度の手法です。一部の手順は、最良の結果を得るために重要です。
その一つがRNA抽出のためのサンプルの適切な取り扱いです。RNAが分解しやすく、結果が影響を受ける可能性があるため、このステップは非常に重要です。プロセス中に約4°Cの寒い条件でサンプルを維持することを検討してください。
さらに、インビトロ転写に記載されているように、数ラウンドのPCR適用が行われることを考慮する。この研究で行われたqRT-PCRアッセイは、組織の1ミリグラム当たりRABV N遺伝子の36.3コピーを検出することができた。qRT-PCRに最も適した脳構造には、皮質および視床が含まれていた。
これは、これらの構造でRABV N遺伝子の濃度が高いことが検出され、また、RABV参照試験を用いて陽性であることが判明した観察に基づいています。この試験では、様々なサンプル中のウイルスの9番目のコピーに0.00023倍の非常に低い濃度を検出することができました。サンプル中のウイルス粒子を定量することに加えて、この試験は、ここで提示されたRABVの検出のための良好な代替診断および研究ツールを提供するように見える。
