動物実験の低減を目的とし、NH検査のばらつきのために、WHOは狂犬病ワクチンの効力を評価するためのインビトロアプローチの開発を奨励する。このELISA試験は、糖タンパク質の免疫原性形態を認識する際の古典的なNH試験との良好な一様を示し、高感度を示し、そして1日以内に行うことができる。ELISAによるインビトロにおける狂犬病ワクチンの効力の評価は、インビボNH試験に代わるものである。
メーカーや国の管理研究所によって推進されています。希釈ごとに事前サイズのボリュームを複製して配布し、この手順を避けるために、この手順を避けるために、使用できるコート、手袋、マスク、メガネを含む適切な個人保護装置を着用するために、水解後に吸収性紙のプレートをよく乾燥させることが重要です。汚染された材料を除染のために30分間2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液に浸して処理します。
次に、96ウェル免疫アッセイプレートをセットし、各ウェルに炭酸塩緩衝液で希釈したモノクローナル抗体の200マイクロリットルを加えます。粘着フィルムでプレートを覆い、加湿環境で37°Cでマイクロプレートをインキュベートします。次に慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むレシピエントにウェル含有量を移す。
マイクロプレートを反転させ、室温で吸収性紙で5分間乾燥させます。まず、パッシベーションバッファーの 300 マイクロリットルを各ウェルに追加します。粘着フィルムでプレートを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
この後、2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むものにウェルの内容物を移す。プレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。次に慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウムの溶液を含むレシピエントにウェル含有量を移す。
この洗浄工程を5回繰り返して、感作板を広範囲に洗浄する。この後、マイクロプレートを反転し、室温で吸収性紙の上で1分間乾燥させます。狂犬病ウイルス糖タンパク質の最終濃度が1ミリリットル当たり10マイクログラムになるように、1ミリリットルの蒸留水で基準ワクチンを再構成する。
1ミリリットル当たり1マイクログラムの狂犬病ウイルス糖タンパク質濃度に到達するために、希釈剤中の再構成された参照ワクチンの10倍希釈を調製する。次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、この参照ワクチンの6つの逐次希釈を希釈剤で行う。重複するウェルに希釈液の200マイクロリットルを分配し、重複する各基準ワクチン希釈に対して、1ウェルあたり200マイクロリットルをブラインドコントロールとして機能する。
次に、希釈剤中に試験ワクチンの10倍希釈を調製し、テキストプロトコルの表2に概説されているように、試験ワクチンの7倍の連続希釈液を希釈剤で調製する。各試験ワクチン希釈液をマイクロプレートの各ウェルに200マイクロリットルずつ配布する。マイクロプレートを粘着フィルムで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。
この後、フィルムを取り除く。吸気を慎重にし、2.7%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。プレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。
洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、非結合抗原を除去し、コーティングされた抗体に結合したGタンパク質三量体を節約する。洗浄したマイクロプレートを反転し、室温で吸収性の紙の上で1分間乾燥させます。次に、D1モノクローナル抗体を各ウェルに希釈剤で標識したペルオキシダーゼの推奨希釈液の200マイクロリットルを分配する。
マイクロプレートを粘着フィルムで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、フィルムを取り出し、慎重に吸引し、2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。マイクロプレートを洗浄するには、各ウェルに300マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。
吸気を慎重にし、2.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに各ウェルの内容物を移す。この洗浄プロセスをさらに5回繰り返して、標識抗体の非結合ペルオキシダーゼを除去する。洗浄したマイクロプレートを反転し、室温で吸収性の紙の上で1分間乾燥させます。
次に、各ウェルに200マイクロリットルの基質染色体溶液を分配する。マイクロプレートをフィルムで密封し、暗闇の中で室温で30分間インキュベートします。その後、各ウェルに停止溶液の50マイクロリットルを加え、反応を停止します。
マイクロプレートの底を慎重に拭き取り、分光光度計に入れる。使用するすべてのウェルについて、492ナノメートルの光学密度を決定します。分析のためにこのデータをスプレッドシート ファイルに収集します。
その後、テキストプロトコルで概説されているように、参照ワクチン曲線と光学密度値の両方のプロットを作成します。本研究では、狂犬病ワクチンの効力を評価するために、in vitro ELISA試験を用いる。代表的な実験の光学密度値を以下に示します。
これらの値は、基準ワクチンの異なる希釈に対する平均光学密度を縦軸にプロットし、かつ水平軸上の糖タンパク質の濃度をプロットすることによって、基準ワクチン曲線を描くために使用される。試験されたワクチンの糖タンパク質含有量は、この曲線を使用して推定される。評価は、基準ワクチン曲線のライナー領域に平均光学密度値を有する希釈に対して正確である。
1対40の希釈を考慮すると、x軸上のOD1534の垂直投影は、1ミリリットル当たり500ナノグラムに相当する。したがって、試験されたワクチンは、糖タンパク質の1ミリリットル当たり20マイクログラムと推定される。体外効力が確立されると、試験ワクチンを国際単位で校正された6つのWHO国際標準と比較する必要があります。
同じ方法は、古典的により可変的である獣医ワクチンに使用されるものを含む、より多くのワクチン株の検出を拡大するために他の抗体と併用することができる。抗体はまた、馬またはヒト血清中の抗可愛抗体の滴定の競争に使用することができる。予防措置は、不活化していないワクチンやウイルスを伴って服用する必要があります。
必ず、個人用保護具を使用し、手袋を着用し、すべてを適切に除染してください。また、発がん性のある錠剤や酸性次亜塩素酸ナトリウム溶液にも注意してください。
