この方法は、宿主のアミノ応答に関与するコーディング、非コーディング、およびウイルスRNA発現の検査と、病原体が宿主の生物学的機能にどのような影響を与えるかを調べることによって、宿主と病原体の相互作用の研究における主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、単一の全血サンプルからのグロビン還元RNAseqライブラリーからのmRNAおよび非コードRNAの処理に最適化されたプロトコルを提示することです。この技術のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるサラ・アンダーソンです。
室温で10分間Gの50 20倍の血液管を遠心から開始します。生物学的安全キャビネットで作業し、上清を除去した後、ペレットにRNaseフリー水の8ミリリットルを追加します。チューブを閉じ、ペレットを目に見えて溶解するまでペレットを渦巻きし、その後、チューブを室温で10分間G50 20倍に遠心し、ペレットを回収する。
生物学的安全キャビネットで作業し、上清を捨ててペレットを保存します。総RNAを単離するには、300マイクロリットルのリシス結合バッファーをペレットにピペット処理して開始する。ボルテックス後、各チューブから新しいラベル1.5ミリリットル遠心管に混合物を移します。
miRNA分離キットから30マイクロリットルのホモジネート添加剤を加えます。チューブを渦し、氷の上に10分間置きます。ヒュームフードで作業し、氷からチューブを取り除き、キットから酸フェノールクロロホルム試薬の300マイクロリットルを追加し、再び渦を混ぜます。
室温で5分間Gを10,000倍に遠心した後、新しいチューブに水相を慎重に除去する。前工程からの水性回収量に基づき、各チューブとピペットの水性ファージに1.25倍のエタノールの体積を加えて混合する。各サンプルにフィルターカートリッジを含む新鮮な回収管を準備します。
約675マイクロリットルのリゼット-エタノール混合物をフィルターカートリッジにピペット。遠心分離機はGの10,000倍で液体をフィルターに通す。フロースルーを破棄します。
完全に使用されるまで、フィルターに加えて遠心分離するライセートエタノール混合物を繰り返します。700マイクロリットルの洗浄液をキットからフィルターカートリッジに加えます。フィルターを介して溶液を引っ張るために遠心分離機を簡単に。
フロースルーを破棄し、同じフィルターカートリッジとコレクションチューブを保持します。各フィルターカートリッジに500マイクロリットルの洗浄液を2~3個加えます。再度遠心した後、流れを捨てて、洗浄工程を繰り返します。
フィルターカートリッジから残った液体を取り除くために、さらに60秒回転させます。カートリッジを新しい回収管に移します。各フィルターカートリッジの中央に95°Cの予熱ヌクレアーゼフリー水の100マイクロリットルを加えます。
最高速度で卓上遠心分離機で約20〜30秒間カートリッジを遠心分離します。グロビン還元オリゴによるハイブリダイゼーションをプレフォームするには、まず抽出した各サンプルを0.2ミリリットルの薄肉ヌクレアーゼフリー反応チューブに加えてRNAを変性させた。チューブをサーマルサイクラーに2分間摂氏70度に入れます。
その後、すぐに最適なRNA品質を得るために氷の上にチューブを置きます。チューブが冷却されている間、400マイクロリットルの10Xグロビン還元オリゴミックスと10Xオリゴハイブリダイゼーションバッファーを2ミリリットルチューブに調製します。ハイブリダイゼーションミックスを作るために、RNAサンプル6マイクログラム、10Xグロビン還元オリゴミックスの2マイクロリットル、10Xオリゴハイブリダイゼーションバッファーの1マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水を各0.2ミリリットルの薄肉、ヌクレアーゼフリー反応チューブにそれぞれ10マイクロリットルの最終体積に加えます。
チューブをサーマルサイクラーに摂氏70度で2分間置きます。その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。RNase Hの消化を行うために、最初に10X RNase Hを1つのX RNase Hバッファーで1つのX RNase Hに希釈した。
RNase H反応ミックスを調製し、10X RNaseバッファーの2マイクロリットル、RNase阻害剤の1マイクロリットル、1つのX RNase Hの2マイクロリットル、および5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を合計10マイクロリットルに組み合わせます。10マイクロリットルのRNase H反応ミックスをグロビン還元ハイブリダイゼーションサンプルに加え、十分に混合します。この反応を摂氏37度で10分間消化し、摂氏4度まで冷やします。
0.5モルEDTAの1マイクロリットルをチューブに加えて消化を停止し、チューブの全内容を新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。その直後に、80マイクロリットルのRNaseフリー水、350マイクロリットルのライシスバッファーを加え、各チューブに250マイクロリットルの100%エタノールを加え、ピペットでよく混ぜます。700マイクロリットルのサンプルを、2つのミリリットルの回収チューブに入れた別の溶出フィルターカートリッジに移し、フロースルーを収集します。
遠心分離機は8,000倍以上で15秒間G以上を行い、流れ通りを破棄します。同じ溶出フィルターカートリッジを新しい2ミリリットルの回収チューブに入れる。フィルターカートリッジ膜を洗浄するには、軽度の洗浄バッファーをフィルターカートリッジに500マイクロリットル、遠心分離機を8,000倍G以上で15秒間加えます。
フロースルーを破棄します。次に、同じ回収管を使用して、フィルターカートリッジに80%エタノールの500マイクロリットルを加える。8,000倍G以上で2分間遠心分離機。
フロースルーとコレクションの両方のチューブを廃棄し、溶出スピンカラムを保存します。各溶出スピンカラムを新しい2ミリリットルの回収チューブに入れる。フィルターカートリッジの開いた蓋で5分間フルスピードで遠心分離機を使用し、スピンカラム膜を乾燥させ、エタノールの持ち越しを防ぎます。
回収管を捨て、乾燥した各フィルターカートリッジを1.5ミリリットルの新鮮な回収管に入れる。14マイクロリットルのRNaseフリー水をフィルターカートリッジ膜の中央に直接加えます。RNAを溶出させるために、チューブを全速力で60秒間遠心分離し、さらにRNA評価と調製を続けます。
グロビン枯渇サンプルは分割され、小さな非コードRNAライブラリだけでなく、リボ枯渇mRNAおよび長く非コード的なRNAライブラリを準備するために使用することができます。このプロトコルを使用してグロビン枯渇およびリボ枯渇した全血サンプルの発現ライブラリを調製した後、電気泳動ファイルの実行概要は、6.3から9.2の範囲のRNA完全性番号を有するグロビン枯渇したライブラリサンプルを示した。これは、グロビン枯渇法を使用し、6またはほぼ6でRIN数を達成することができた他の研究と比較して改善であることが判明しました。
単一のブタ全血サンプルのグロビン前還元およびポストグロビン還元は、260〜280ナノメートル濃度比が2以上であることを示した。このプロトコルを用いて、プーリングおよびシーケンシングの前に、グロビンおよびリボが枯渇した全血mRNAライブラリーサンプルのチップベースのエレクトロフェログラムが得られた。mRNAライブラリーの場合、代表的なエレクトロフェログラムは約280塩基対でピークを有する。
小さなncRNAの代表的なチップベースのエレクトロフェログラムには、約100から400塩基対までのピークの範囲が含まれています。約143塩基対のピークはmiRNAに対応し、約153塩基対のピークはpiRNAに対応する。この手順を試みる間、注意した場所ですぐに氷管を覚えておくことが重要です。
この手順に従って、微分発現、エピジェネティックな変化、および生物学的経路およびプロセスへの影響などの追加の質問に答えるために、次世代シーケンシングのような他の方法を実行する必要があります。フェノールクロロホルム試薬を使用すると非常に危険であり、ヒュームフードで作業などの予防措置を取る必要があることを忘れないでください。また、全血または感染性生物を取り扱う場合、感染性生物の活性化に先立って生体安全キャビネットで作業を行う必要があります。
