このプロトコルは、脊髄系の機能に対するトランス脊髄直流刺激の影響を直接調査するために、脊髄モトニューロンの細胞内記録を使用する。この技術の主な利点は、完全に成熟した神経系で細胞内記録を行うことができるということです。実験観察の実用化への翻訳を促進する。
ペダル反射への応答の欠如を確認した後、麻酔6ヶ月の雄のウィスターラットは、解剖顕微鏡と数21ブレードを使用して、胸骨から顎への縦方向の皮膚切開を行う。そして、右頸静脈を露出させるために鈍い解剖を使用してください。分岐点なしで静脈のセクションの下に2、4-0の合字を置きます。
そして、静脈セグメントの近位端に1つの緩い結び目を作ります。そして、セグメントの遠位端に1つの緩い結び目。心臓に近位静脈をクランプし、静脈の遠位端をリゲートします。
虹彩はさみを使用して、クランプと遠位合字の間に切開を行います。そして、静脈のフラップを保持し、静脈がクランプによってブロックされるポイントに事前に充填されたカテーテルを導入する。クランプを外し、カテーテルを数ミリメートル静脈に押し込みます。
気管チューブの配置には、鈍い鉗子を使用して、ステルノイド筋肉を覆う2つの下顎腺を分離します。そして、中線でステルノヒノイド筋肉を分離し、気管を露出させる。気管の下に 3 つ 4-0 の合字を配置し、気管チューブ挿入ポイントの下に 2 ノット、上に 1 ノットを作成します。
その後、気管チューブを第3気管軟骨の下の気管に挿入します。そして、事前に準備された合字で所定の位置にチューブを固定します。後肢神経を解剖するには、21番の刃を使用して、アキレス腱から股関節まで、左後肢の後部側に縦切りを作ります。
そして、膝関節の後ろにある、膝窩の前部と後部領域の間に切り傷を作るためにはさみを使用してください。上腕二頭筋の2つの頭部を切り、坐骨神経を露出させる。そして、胃頭筋の内側頭から横方向の頭部を分離し、脛骨神経とその枝を露出させる。
その後、数55鉗子を使用して、内側胃腸および横胃腸およびソレウス神経を慎重に解剖する。筋肉のそれぞれの接続を維持しながら、周囲の組織からそれらを切断します。.ラミネクトミーを行うために、数21の刃を使用して、仙骨から胸椎までの縦切開を行う。
そして、胸部の最も低い胸部セグメントとして、胸椎を識別します。次に、細かい回転器を使用して、Th13からL2椎骨までの棘プロセスとラミナエを除去し、脊髄の腰部を露出させます。椎骨柱を固定するには、閉じたループ加熱システムに接続された37°Cの加熱パッド上のカスタムメイドのフレームにラットを置きます。
そして、皮膚のフラップを使用して、露出した脊髄の上に深いプールを形成します。Th12横方向のプロセスの下に金属クランプを配置し、L3のスピンプロセスで、37°Cの鉱物油でプールを充填します。皮膚フラップを使用して、露出した脛石、内側胃腸および側面胃腸およびソレウス神経の上にミネラルオイルの深いプールを作ります。
そして、双極性銀線刺激電極上に神経を置きます。次に、各神経に対して別々の刺激チャネルを使用して、電極を正方形のパルス刺激装置に接続します。表面電極の配置のために、解剖顕微鏡の下で、露出した脊髄の左尾側に銀球電極を置く。
後ろの筋肉に挿入された参照電極と。両方の電極を差動DCアンプに接続します。一定の電流刺激器を使用して、内側胃食道および側胃腸およびソレウス神経を刺激し、0.1ミリ秒の持続時間の正方形のパルスを3つのヘルツ周波数で繰り返し、帯電性ボレーを観察する。
シミュレーションの最後に、表面電極をロストラリーに動かし、刺激を繰り返して、各神経のバレーの振幅が最も高い脊髄セグメントを特定する。最大ボレーの位置を決定した後、ラットを麻痺させるために静脈内に神経筋遮断剤を送達する。アシスタントはげっ歯類の互換性のあるキャップの指名者と一直線に外気管の管を外の換気装置に接続している間。
硬膜およびピアマーターを開くには、55番鉗子を使用して硬膜を静かに持ち上げ、L5セグメントからL4セグメントまで組織を硬膜状に切断します。次に、超薄型5SF鉗子のペアを使用して、血管間の後列を覆うピアに小さなパッチを作ります。正確には内側胃腸および横胃腸およびソレウス神経からの最大のアフェレントボレーのレベルで。
トランス脊髄直流刺激電極を配置するには、Th12椎骨の背骨側に生理食い浸したスポンジを置きます。そして、アクティブなトランス脊髄直流刺激電極でスポンジを押すために微細な操作を使用します。次に、カスタムプールされたマイクロ電極をマイクロマニピュレータに取り付け、1〜2ミクロンのステッピング運動と立体キャリブレーションを可能にする。
そして、15〜20度内側の横の角度で、pia内の選択されたパッチにマイクロピペットチップを駆動します。モトニューロン膜および焼成特性を記録するために、細胞内増幅器のブリッジモードにおいて、それぞれの神経枝を刺激して、全てまたは何も出現しない、抗血色作用電位のモトニューロンを同定する。現在の切り替え速度モードが4〜8キロヘルツの細胞内増幅器の不連続電流クランプモードでは、0.5ミリ秒の細胞内脱分極電流パルスを使用して、モトニューロンにおける矯正作用電位を呼び起こす。
細胞入力抵抗を計算するには、1ナノグラム電流を超分極する40短い100ミリ秒パルスで、モトニューロンを刺激する。単一のスパイクを引き出すために必要な脱分極電流の最小振幅として実底値を決定するには、振幅を増加させると50ミリ秒の方形波パルスでモトニューロンを刺激する。次に、振幅を増加させると、脱分極電流の500ミリ秒の方波パルスを注入します。
0.1〜2ナノアンプステップで、モトニューロンのリズミカルな放電を呼び起こす。トランス脊髄直流刺激の場合は、モトニューロンの安定した浸透を維持しながら、直流のトランス脊髄適用により偏光手順を開始する。ここで、典型的な異方性作用電位は、データ包含の全ての基準を満たす細胞内刺激によって誘発される、図示される。
本分析では、1ナノグラムの100ミリ秒超分極電流パルスに対する細胞応答を示す。そこからモトニューロンのピークとプラトー入力抵抗の両方が、電圧偏向から決定することができ、観察することができる。この膨張した電圧トレースは、実際の基本スパイクの、スパイクの電圧閾値を明確に示す。
電圧ゲート付きナトリウムチャネルが活性化され、作用電位を開始する膜脱分極のレベルを示す。これらのグラフは、細胞内電圧トレースの例を示しています。2つのモトニューロンから、脱分極電流の500ミリ秒四方パルスで細胞内刺激を受ける。
トランス脊髄直流刺激アプリケーションの前、中、後。アノダルトランス脊髄直流刺激は、増加したモトニューロン興奮性およびリズミカルな発火の高い周波数に向けて作用することが判明した。陰極トランス脊髄直流刺激をしながら、発火抑制に向けて行動した。
さらに、両方のタイプのトランス脊髄直流刺激の効果は、分極の期間を上回った。不完全な細胞浸透のためにデータ包含基準が損なわれた場合、不正確なデータを取得できます。微小電極抵抗とキャパシタンスまたは脊髄不安定性を補うことができない。
損傷は脊髄ショックを引き起こし、さらなる記録を不可能にする可能性がありますので、解剖中に脊髄に損傷を与えないことが不可欠です。組織サンプルをさらに組織学的または免疫細胞の化学分析のために採取することが可能です。例えば、c-fos発現の測定は、神経活動の代理として使用することができる。
