この方法は、神経系の発達中に軸索誘導および神経移動におけるいくつかの分子の役割を分析するために有用である。この手法の主な利点は、結果の分析が迅速かつ簡単であり、研究者のための多くのトレーニングを意味する複雑なソフトウェアを必要としないということです。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室と私の技術者であるミリアン・セグラ=フェリウです。
プレート200、000 COS-1細胞を35ミリメートルのペトリ皿に開始し、一晩70〜80%のコンフルエンスを読み取るために細胞培養インキュベーターで完全な培養培地でインキュベートする。翌日、リポソームベーストランスフェクション法を用いて候補分子をコードするDNAを用いてCOS-1細胞をトランスフェクトする。まず、250マイクロリットルの無血清培地と1~2マイクログラムのDNAを1.5ミリリットル遠心管に混合し、室温で5分間インキュベートします。
リポソームチューブを調製するには、240マイクロリットルの無血清培地と10マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を加え、室温で5分間インキュベートする。インキュベーション後、DNAチューブの含有量をリプソームチューブに加えます。室温で15分間静かに混ぜ合わせてインキュベートします。
培養した細胞上の培地を1.5ミリリットルの無血清培地に交換します。DNAリポソーム混合物をゆっくりと加え、細胞に賢明に落とします。炭酸ガス細胞培養インキュベーター中で3時間インキュベートする。
インキュベーションが完了した後、培地を完全な培養培地に交換し、インキュベーターで一晩インキュベートする。翌日、0.1モルのダルベッコのPBSで細胞をすすいだ。各皿ごとに800マイクロリットルのトリプシンEDTAを加え、二酸化炭素インキュベーターで5〜15分間インキュベートします。
完全な培養培地の2ミリリットルを含む剥離細胞を15ミリリットル遠心管に集め、同じ培地の10ミリリットルを加える。細胞を摂氏4度で130倍gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、氷上にCOS-1細胞を含むペレットを保存します。
コラーゲンの作業混合物を調製した後、トランスフェクション細胞のペレットにコラーゲン混合物の100〜150マイクロリットルを加え、上下にピペットを入れて穏やかに混合します。45~50マイクロリットルのコラーゲン細胞ペレット混合物を35ミリメートルのペトリ皿に広げ、長さ約1〜1.5センチメートルの均一なバンドを形成します。培養物に37°C、炭酸ガス5%で、ゲル化が観察されるまで皿を置きます。
第2培養皿にコントロール細胞を含む第2のストリップを準備し、インキュベーターに入れます。ゲル化が完了したら、37°Cの3〜4ミリリットルを加えて、ゲル化したコラーゲン細胞ストリップを含む各皿にCOS-1完全な培養培地を加え、インキュベーターに入れます。細かいメスまたはティッシュチョッパーを使用してコラーゲン細胞ストリップを切断し、長さ400〜500マイクロメートルの小さな正方形の部分を生成します。
同じトランスフェクション条件から、3~3.5ミリリットルの神経培養培地を含むペトリ皿にすべてのセクションを移します。解剖顕微鏡でピースの品質を確認し、調理器に皿を置きます。はさみを使用して、犠牲にされた妊娠中の雌ラットの腹腔から胚の角を16.5日目に切断し、冷たいHBSSgバッファーを含む大きなペトリ皿に入れます。
皿を層流フードに入れ、まっすぐな鉗子を使って胚を抽出し、冷たいHBBSgを含む新しい皿に入れます。小さな鉗子で、皮膚を取り除き、湾曲したまっすぐな鉗子で、脳を慎重に解剖し、冷たいHBSSgを含む皿に入れる。解剖顕微鏡の下で、メスまたは細かいはさみを使用して、両方の半球を分離するために正中線に沿って半分に脳を切断します。
次に、脳の中から、細かい鉗子で、脳の部分から髄膜や血管を取り除きます。100%エタノールを使用して、組織チョッパー、特にPTFE切断板とカミソリブレードのすべての部分を洗浄し、15分間UV照明下の層フラックスフードに組織チョッパーを保管してください。各組織片を組織チョッパーの切断板に移す。
組織が切り刻まれた後、完全なNCMの3〜4ミリリットルで満たされた35ミリメートルペトリ皿から作品を転送します。細かいタングステン針を使用して、完全なNCMで組織解剖を終了します。解剖顕微鏡で得られたスライスの品質を確認し、層が暗視野光学で明確に識別可能であることを確認し、タングステン針で関心領域を解剖します。
二酸化炭素インキュベーターで完全なNCM培地に良質の部分を保管してください。視覚的なデモンストレーションは、プロセスを理解するために単語を容易にする共文化の準備に関連する手順で重要です。いくつかの滅菌4ウェル培養プレートを層流フードに入れ、以前のようにコラーゲン作業混合物を調製する。
各ウェルの底にヒドロゲル混合物の15〜20マイクロリットルを加え、円形のコラーゲンベースを作り出します。完全なゲル化が観察されるまで、食器をインキュベーターに入れる。そして、ゲル化したコラーゲンの品質を確認してください。
ピペットを使用して、COS-1細胞凝集体の小片をヒドロゲルベースに移し、ピペットを使用して組織片を同じベースに配置し、1つの外植体サイズの距離で凝集した細胞片の近くに置きます。氷の上に新しい働くコラーゲン混合物を準備した後、外植および細胞凝集体をカバーするために、この新しい混合物の15〜20マイクロリットルを穏やかにピペットし、ヒドロゲル培養のようなサンドイッチを作る。500~600マイクロメートルで細胞の凝集体に向かうために、細かいタングステン針を使用して外植体の向きを変えます。
ゲル化が観察されるまでプレートをインキュベーターに戻し、2%B27サプリメントで完全なNCMを0.5ミリリットル加え、培養器で36〜48時間培養します。海馬軸索がNetrin-1に直面したとき、彼らはNetrin-1の供給源に向かって優先的に成長し、Netrin-1がこれらの軸索のケモ魅力的な分子として機能することを示した。制御条件、または模擬トランスフェクションでは、すべての軸索は方向の好みなしに放射状に成長した。
海馬軸索がSema3E分泌細胞に直面したとき、それらのほとんどは細胞凝集体の反対に成長し、Sema3Eがこれらの軸索の化学反発分子として機能することを示した。軸索応答および定量法のこの模式的表現は、制御条件において、軸索が近位および遠位象限の両方で均等に分布していたことを示し、放射状の成長で示した。これは、近位遠位またはPD比が1の近位遠位またはPD比を示した。
外植木が近位象限で近位象限の軸索の増加を示した場合、近位の軸索は、近位の引力を示し、その後、PD比は1より大きかった。軸索の数が近位の軸分よりも遠位象限で高かった場合、化学反発を示し、PD比は1未満であった。この方法に従って、研究者は神経細胞の発達中に一部の分子の役割に関する重要な情報を得ることができ、機能をさらに探求するための出発点を確立することができます。
この技術は、このように神経細胞の発達に有用であるが、それはまた、戦略として薬理学的スクリーニング、血管新生、および組織工学に適用することができる。
