ここでは、結晶セルロース含有量の推定に世界で最も広く使用されているUpdegraff法を例示します。セルロースは、基本的にはβ-1、4グリコシド結合によって結合したグルコースモノマーで構成されています。このプロトコルを5つのフェーズに分けた。
第1段階では、植物バイオマス材料を調製する。第2段階では、粗細胞壁を抽出する。第3段階では、Updegraffがサンプルからヘミセルロースとリグニンの除去に役立つ酢酸と硝酸で構成されているUpdegraff処理を使用します。
第4段階では、グルコースモノマーを生成する硫酸の助けを借りて酸加水分解を行います。最後に、第5段階では、結晶セルロース含有量を推定するために、即位アッセイを使用します。温室から植物材料を収集し、水で十分に洗浄し、2日間空気乾燥し、組織を分離し、組織を個別に標識された容器に移し、インキュベーターで49°Cで10日間インキュベートします。
最後に、はさみや刃を使って切り取ります。均一な粉末に細かく粉砕するための組織とモルタルと害虫に負荷を凍結するか、または代わりにフリーザー/ミルを使用してください。ここでは、冷凍庫/ミルを使用してデモンストレーションを行うので、これらの粉砕バイアルに組織サンプルをロードし、フリーザー/ミルに入れて、3サイクルで10 CP速度を実行します。
組織粉末は、ここに示すようにファルコンチューブに集められます。組織粉末の20mgの重量を量り、予め計量された2つのmLチューブに移す。タンパク質の可溶化バッファーの 1 つの mL を追加して、タンパク質を除去します。渦動。
遠心分離機で15,000 RPMで5分間。上清を捨てます。この手順をさらに 2 回繰り返します。
保持されたペレットに滅菌水1mLを加えます。渦動。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。この手順をさらに 2 回繰り返します。
70%エタノールの1 MLを保持ペレットに加えます。渦動。1時間同時に揺れる予熱70度の摂氏ブロックに移します。1時間のインキュベーション後、遠心分離機を15,000 RPMで5分間行う。
この手順をもう一度繰り返します。保存したペレットに、100%メチロンの1mLを加える。渦動。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。
1 mLのクロロホルムメタノールを加えます。渦動。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。上清を捨て、1mLのアセトンを加えます。渦動。
室温で5分間インキュベートします。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。上清を再捨て、空気は一晩摂氏37度でそれらを乾燥させるか、真空乾燥によって継続します。
サンプルを真空乾燥機に積み込み、2~3時間、またはペレットが完全に乾燥するまで空気乾燥します。前工程から得られた細胞壁抽出物の5mgを秤量する。2つのmLスクリューキャップチューブに移します。
また、この時点で正のコントロールを含めます。その目的のためにWhatmanフィルターペーパーの2mgを使用してください。2つのmLスクリューキャップチューブに移します。
各計量細胞壁抽出物に1.5 mLのUpdegraff試薬を加えます。渦を、予熱されたブロックで摂氏100度で30分間インキュベートする。30分のインキュベーションの後、ラックに移します。
ベンチで10分間冷まします。遠心分離機を15,000 RPMで10分間行う。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
滅菌水を1mL加えます。渦動。遠心分離機を15,000 RPMで10分間行う。上清の500マイクロリットルを捨てる。
アセトンを1mL追加します。渦動。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。上清のmLを1個捨てます。
アセトンを1mL追加します。渦動。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。上清を完全に捨てよ。
アセトンを1mL追加します。渦動。遠心分離機で15,000 RPMで5分間。上清を捨てます。
一晩摂氏37度で乾燥。1泊のインキュベーションの後、ラックに移します。67%の硫酸の1 mLを加えます。渦動。
摂氏25度で1時間、同時に揺れ動く。1時間のインキュベーションの後、ペレットが完全に溶解していることを確認してください。ラックに転送します。
これはセルロース抽出の最終ステップです。これでサンプル希釈の準備が整いました。サンプル希釈の場合は、前のステップから各サンプルの10マイクロリットルを使用し、滅菌水の490マイクロリットルを追加します。
すべての実験サンプルに対してこれを繰り返します。グルコース標準曲線調製物の場合、1 mLグルコースに1mgの新鮮なストックを調製し、20マイクロリットル単位で1mg/mLグルコースを1mgずつ添加して0マイクログラムから200マイクログラム濃度に調製し、最終体積を無菌水で1mLにします。スクリューキャップチューブに用意された各標準の500マイクロリットルを取り、1 mL 0.2%の玉座を追加します。
そして今、サンプルは即位アッセイの準備ができています。準備したての王位の1つのmLを追加します。渦をかいてすぐに混ぜ、氷に移します。
すべての標準とサンプルについても同じ方法で繰り返します。その後、予熱した摂氏100度のブロックに10分間移します。10分のインキュベーションの後、氷に移し、氷の上で5分間インキュベートします。
インキュベーション後、各サンプルの200マイクロリットルを3回の複製で取ります。同じ方法で、標準とサンプルの両方に対して繰り返します。そして、ロードされた96ウェルプレートは、マルチモード検出器にロードされました。
スマートマックスプロプログラムを使用して、フィルタ設定を620ナノメートルに設定しました。プレートタイプは96ウェルタイプに。すべての読み取り領域を選択します。
[OK] をクリックします。読む。プレートを読んでください。セルロース含有量のさらなる分析と推定のためにExcelシートに収集される標準とサンプルの両方の吸光度測定値を取得します。
グルコース標準曲線は、x軸上のmL当たりのマイクログラムのグルコース濃度と、y軸上の620ナノメートルでのそれぞれの濃度の正規化された吸光度値を用いて調製される。サンプル結晶セルロースの含有量を推定するために使用するプロットされた散布図のmとcの値を持つ回帰線を取得します。最初のステップでは、620ナノメートルでのOD値を平均化しました。
次に、空白の値を減算してデータを正規化しました。式xを用いてグルコース濃度を計算し、ODマイナスc/mに等しく、標準曲線の回帰直線の前のステップからcとmの値を差し込みます。即位アッセイに使用された総体積は500マイクロリットルなので、希釈因子2で割ります。
使用されたサンプル量はわずか10マイクロリットルであったため、さらに10分け、10マイクログラムのグルコース濃度当たりマイクログラムを得ます。そして、その過程で水分が得られる水分係数1.11を使用しました。そして最後に、5mgに近い細胞壁の重量で割って結晶セルロースのパーセントを計算し、パーセントを得るために100を掛けます。
次に、3つの生物学的複製物の結晶セルロース含有量を平均して個々のサンプルの値を取得し、3つの生物学的複製の別の実験ライン平均と比較する。t検定を使用して、その重要性のレベルをテストすることができます。ここで表Aでは、620ナノメートルの濃度とそれぞれのODの表値を示し、2本の実験線間のセルロース含量差を得るためにCで使用されたmおよびc値を用いた散布図および回帰線をプロットするためにさらに用いた。
結論として、両方のサンプルはセルロースの違いを示す。見てくれてありがとう。
