私たちは、原稿の批判的検討のためにブライアン·K·ウォッシュバーンに感謝KMJに20582 - この作品は、米国農務省国立食糧農業研究所、農業·食品産業技術総合研究イニシアティブ助成金2010から65108によって賄われていた。

ステップを実行することは、1、2、4、および無菌層流フード6が推奨される。 1。 Mの準備truncatula A17苗注：M. truncatulaこれらの研究で使用A17種子は約22℃で、または〜150〜400ミリモル/ mは22〜26℃に維持し、植物生育室で冷却し、温室条件下で生産され-2 s -1の光。 <ol><li>種子の発芽プレートを注ぐ：100ミリメートルの正方形プレート（深い15ミリメートル）を使用し、3〜5 mmの深さまで10寒天を精製w / vのオートクレーブ処理1.1から1.2パーセントを注ぐ。各プレートは（63から125個/プレートに相当）の種子〜0.25〜0.5グラムを発芽するために使用されます。 注：このプロトコルで説明されているすべてのプレートのための植物細胞培養テスト済み、精製された寒天を使用することが重要です。寒天のベンダーとカタログ番号の情報は、特定の試薬および装置の表に記載されています。 </li><li>表面を傷つける/ Mを殺菌truncatula A17シードS：苗、所望の数のための十分な種子を計量する。 （;これは〜63から125の種である0.25〜0.5グラムシード/フラスコ）ピペット濃厚の20ミリリットル（96％）、滅菌ホイルカバー付きの滅菌125ミリリットルのフラスコに種を置きます（M.は A17種子が〜4mgのそれぞれtruncatula） H 2 SO 4をフラスコの側面に沿っ。 注意：酸乱切種子を殺菌します。また、フラスコの側面に沿っ酸ピペッティングすることによって、それが未滅菌種子に接触したフラスコ内に再滅菌するであろう。 </li><li>滅菌ガラスピペットを用いて種子の塊を壊す。 10月12日分頻繁に各フラスコを旋回。小さな茶色のピットが、種子に見えるようになります。これらは、種皮11の小さな穴である。 注意：濃H 2 SO 4を操作する場合、目の保護と手袋を着用してください。 </li><li> 4の H 2 SO を削除し、種子をすすぐ：種子の少なくとも10％は、小さな茶色のピットを持っているか、12分が経過すると、どちらか最初に来る、滅菌ガラスピペットを用いてフラスコからすべての酸を除去する。 （少なくとも300ミリリットルの水道水を入れた1〜2リットルのビーカーに置き、廃酸が、これは、酸を希釈し、過熱を防ぐことができますが。）をフラスコの曲線の残りの酸を収集し、小さなガラスピペットを使用するために、フラスコを傾けて残りのすべての酸を除去。残留酸が残っている場合、それは、すすぎ水と反応し、種子を加熱して、それらを殺します。 <ol><li>すぐに各フラスコに滅菌超純水100mlを注ぐことによって、種子を洗浄します。水の過剰量は、酸を希釈し、水と酸との反応の間に過熱し、種子の損傷を防ぐことができます。水を捨て、フラスコのリップを火炎滅菌する。 </li><li>滅菌超純水50mlでシード8-10Xを洗浄します。各すすぎ中にフラスコを旋回。フラスコは、この時点で無菌考慮されるべきで、フラスコのリップは、各すすぎの前に燃え上がっする必要があります。 </li></ol></li><li>種子は一晩を吸収しましょう​​：アフター最後のすすぎは、暗い一晩中4℃で各フラスコや場所に無菌ホイルカバーを交換して、各フラスコに50ミリリットル滅菌超純水を注ぐ。 </li><li>発芽プレートの上に置いて、種子：せる種子は一晩吸収した後、種子を再懸濁してから1.1から1.2パーセント寒天発芽プレート上にそれらを注ぐために20ミリリットル滅菌超純水、渦を追加し、約25mL超純水で2回すすぎ、水を注ぐステップ1.1。種子はフラスコ内に残っ​​ている場合は、より多くの水を追加してから注ぐ。 1プレート（63から125個/プレート）に各フラスコからの種子を配布します。 <ol><li>種を配布するために、プレートを旋回。種子は、プレートの一端で4〜5センチメートル帯域に均等に分布されるべきである。これは、プレートの「トップ」になります。 「底」5〜6センチメートルは種子（ 図2A）の自由に保つ必要があります。 </li><li>滅菌ピペットで水を引く。プレートの底に残った水の流出をさせるために45°の角度でプレートを傾けます。ゴマに蓋を交換してくださいテッドプレート、光から保護します。プレートを10〜20分を排出するために許可する必要があります。 （ 図2B）。 </li></ol></li><li>発芽を設定します。滅菌ピペット傾斜プレートの底に溜まった水をすべて削除します。 <ol><li>蓋を交換し、パラフィルムでプレートをシール。手袋を着用した（ 図2C）無菌に保つ。 </li><li>発芽プレートを積み重ねた後、90°の角度でそれらのすべてを上げる。種子は寒天の垂直面に横たわっていることでしょう。完全に吸水種子を簡単に寒天を遵守する必要があります。根は下向き（ 図2D）が成長します。 </li><li>光を遮断し、3日間、25℃で維持するためにホイルで発芽プレートのスタックを包む。 </li></ol></li></ol>注：以下で3日間発芽が進行する場合には、根は小宇宙で寒天に届かない場合があります。発芽は4日以上縮図プレートに移す前に進んだ場合、苗の生存率は意志悪くなる。 M.場合低速の発芽率とのtruncatulaの生態型または変異体が比較されるべきであり、徐々に発芽生態型は、3日以上発芽させなければならない。 2。個々のプレートマイクロコズムの作製<ol><li> Jensenの媒体12を準備します（組成については表1を参照）、各小宇宙のための約70 mlの培地を許可する。急速に注ぐ（投手はなし以上1〜2以上のL）に便利な投手またはフラスコに準備し、オートクレーブ中に投手の磁気攪拌棒を残す。 <ol><li>媒体が約55〜65℃、サプリメントが追加されているために冷却され、pHが（表1を参照）をチェックした後、丸直径100mmに15ミリメートルの深いプレートを注ぐ。プレートは、（〜70ミリリットル/プレート）〜0.9〜1センチメートル深い注ぐべきである。 </li><li> Jensenの培地の成分は、曇った沈殿物を形成することができるので、沈降からコンポーネントを防止するために、定期的に磁気撹拌板に投手を返すことが重要です。析出物はVISかもしれ彼らが固化した後にプレートにible、そして限りが均等にプレートに分散しているように、パフォーマンスには影響しません。 </li><li>プレートの蓋に結露防止のために注ぐ時にプレートを積み重ねる。 </li></ol></li><li> Jensenのプレートが固化した後、U字型5（ 図3A）に屈曲された計量スパチュラで両プレートと蓋ノッチ。レッドホット、ノッチ5-6枚までバーナーでヘラの曲がりを加熱してから、再度加熱する。ノッチ付き蓋がノッチプレート上に置かれたとき、これは、苗の茎（ 図3B）を介して成長される楕円形のポータルを作成する。ノッチプレートを格納する場合には、パラフィンフィルムで個別に包む.. </li></ol> 3。 シノリゾビウム根粒文化の調製二日植物接種前に、全てのSの文化を開始根粒は、苗に接種することが株。 Cultu2.5のMgSO 4、2.5mMのCaCl 2、および適切な抗生物質（TY培地でもうまく機能）を補充した解像度LBMC（ルリア-ベルターニ[ミラー]）中で増殖されるべき媒体13。各培養物のわずか2〜3ミリリットルで十分です。 <ol><li>細胞が密になるまで2日間、振とうしながら30℃で成長する。 </li><li>ほとんどの植物接種のために、Sの成長期根粒は重要ではない。一般的に、後期対数または初期定常期の細胞が用いられる。 </li></ol> 4。 Mをレイアウトする個々のマイクロコズムにtruncatula苗<ol><li> 3日後、（ステップ1で調製）発芽プレートを開いて、すぐに滅菌超純水をフラッディングする。ディップは、エタノールと殺菌する炎を簡単に鉗子。やさしく乾燥を防ぐために水の下で、すべての苗の根の先端をプッシュする滅菌ピンセットを使用しています。根は2〜6センチメートル長距離ます。大半3-4 cmになります。ストレートルーツと明らかなと苗を選択欠陥。 </li><li>結露の蓄積のためにJensenのメディア小宇宙のふたを確認してください。結露を削除するか、新しいノッチ蓋と交換する蓋をフリック。蓋に結露が過剰がある場合は、苗の根は、蓋に付着して、結露が乾燥した後に死亡することがあります。 </li><li>鉗子を使用して、ゆっくりと子葉で発芽プレートから苗を選んで、Jensenのメディア小宇宙に根を置く。根端寒天に接触していることを確認します。 </li><li>それがまだ存在する場合はそっと種皮を取り除きます。種皮には5〜10分間水に浸した後に緩んでなければなりません。静かにそれは方法を提供しますまで、ピンセットで種皮をいじめるし、捨てる。撮影の子葉と約0.5cmのプレート（ 図4A）で、Uノッチから突出しなければならない。丁寧に苗（ 図4B）のためのポータルを作成すること、苗の上に蓋のUノッチプレートの蓋を交換してください。すべての苗が小宇宙上に置かされるまで、水平スタックに置いプレートを設定します。 </li><li>実行可​​能な見て、まっすぐに根を持っているそれぞれの発芽プレートから全ての苗を使用してください。 （可能な場合は、単に接種前しおれた苗の代替品として使用するように未開封の苗の1のプレートにしておきます。） </li><li>すべての苗をレイアウトした後、それらを水平Jensenの小宇宙に座ることを可能にしているが、S.根粒接種懸濁液は、準備されている。 </li></ol> 5。 Sの準備根粒接種懸濁液<ol><li> Sをチェックする定期的に接種後根粒培養は、彼らが成長していることを確認します。 2日間増殖させた後、OD 600は 2と4の間であるべきである。 </li><li>ピペット滅菌した1.5​​mlチューブ、ペレットを遠心分離機に各文化の0.5ミリリットル。上清を取り除きます。 </li><li> 0.85％無菌NaClまたは滅菌超純水のいずれかで細胞を2回洗浄します。 0.5ミリリットル0.85％ステレオで細胞を再懸濁NaClまたは超純水をニトリル。 </li><li>再懸 ​​濁S.の1/10希釈液のOD 600を測定するステップ5.3からメリロティ文化。この読み取りに基づいて、OD 600 = 0.05に滅菌超純水で各培養物の懸濁液とし。細胞密度が高すぎると、根粒形成を抑制することができる。 100μlを各苗に接種することができるように、希釈懸濁液を十分に確認してください。 OD 600 = 0.05懸濁液の濁りは、目でわずかかろうじて認知すべきである。 </li></ol> 6。マイクロコズムの接種とシール<ol><li>直前に始まる接種に、Jensenのメディア小宇宙への転送を生き延びていないしおれた苗をチェック。発芽プレートからの新鮮な苗とのそれらの苗木を交換してください。 </li><li>各小宇宙を開き、適切なS.100μlの接種苗の根の上にメリロティサスペンション。蓋を交換し、水平STACに取っておく6月10日小宇宙のKS。各S.のためのメリロティ株は、比較される、少なくとも15の植物に接種。共生生産性の微妙な違いを持っ​​ている株について、30〜35の植物に接種。ネガティブコントロールとして未接種の少なくとも10の植物を残す。 Sで30〜35の植物に接種メリロティ 1021または他の適切な野生型株を陽性対照として機能する。 </li><li>後にS.メリロティサスペンションは根表面に吸着するための時間を持っていたし、懸濁液を寒天（少なくとも20分）に浸漬している、パラフィンフィルムで個別に各プレートをラップします。プレートは、ノッチの非常にエッジに包まれるべきであるが、パラフィンフィルムは苗（ 図4C）の成長を阻止するべきではありません。 </li><li>ラッピングの際には、プレートの蓋の内側に付着した根のための最終的なチェックを行う。蓋から付着した根を取り除くベンチに平板を置き、寒天SUに戻しダウンルートをノックするように蓋をタップまたはフリックするにデータポート。 </li><li> 6月10日版の各スタックの苗ポータルをラインアップ。上向きの苗（ 図4D）と90°の角度でスタックを置く。パラフィンフィルムの粘着1-2センチのストリップを残して、ホイルでスタック全体を包むように十分な長さの所定の位置にプレートを保持する苗は（ 図4E）出現場所アンラップ。ホイルは光から根を保護します。 </li><li> （16時間明/ 8時間暗のサイクルで21〜25℃、60〜70％の相対湿度および100から175マイクロモル/ M -2 S -1光で照らさ成長チャンバーまたは成長ルームでホイル包まスタックを配置図1A）。これらの成長条件の下で、光レベルでの長時間のインキュベーションは、より高い200μモル/メートル-2 s -1の植物成長に有害な影響を有することができる。 </li></ol> 7。根系と共生の表現型の定量の検討植物は、維持することができる最大9週間の小宇宙。 <ol><li>結節数は、各スタックからホイルをアンラップし、結節を計数することにより一連の時間点で定量することができる。 S.を接種した植物に根粒を開発メリロティ 1021野生型接種後10〜14日で明らかである。 </li><li>共生生産性も新興シュートの長さを測定することにより、各時点で測定することができる。 </li><li>共生の生産の最終定量は、通常撮影を取り外し、撮影の生重量を測定することにより、接種後7週目に行われている。長い成長が必要な場合は、このステップは、後半9週ようにして行うことができる。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

成功のために不可欠なプロトコルのいくつかのステップがあります：1）精製された、植物細胞培養を使用する必要は寒天を強調しすぎることはできませんテストされています。これはアルファルファの苗のために重要ではないが、それはMの成長のために重要であるtruncatula A17。 2）ステップ1に記載したように垂直寒天プレート上に実生を発芽することが重要である。苗の根がま...

マメ科宿主植物ウマゴヤシtruncatula A17とシノリゾビウムは 1021 メリロティ根粒細菌との相互作用は、根粒の発達と窒素固定共生の研究のための最も扱いやすいモデル系の一つである。両方の共生パートナーのゲノムは、1,2を配列決定されており、プラントおよび細菌の両方が遺伝子操作3,4に適している。植物および細菌の変異株の両方の表現型の解析は、根粒の発達の段階を観察し、時間の経過とともに共生の生産性を定量化する能力を必要とします。ここでは、M.の根粒の発達を観察するための方法を記載履歴書をtruncatula。 S.を接種Jemalong A17標準、ラウンド直径100mm、15ミリメートル、深実験室プレート（ 図1A）から作られた個々の小宇宙内メリロティ 1021。シュートは、プレートの側面にある切り欠きのポータル（Figurを介して公開し、成長しているエス1B、1C、および1E）。根は小宇宙の中に含まれているとプレート（ 図1D）の蓋による観察を可能にしながら、無菌保持されます。シュートがアクセス可能であるので、その成長が制約されるものではなく、ルートの無菌性を損なうことなく、定期的に測定することができる。ノッチプレートマイクロコズムを作成する方法は、もともとアルファルファ植物を成長させるためのリーら 5によって開発されたが、それは広く、他の方法に比べて多くの利点にもかかわらず、採用されなかった。この方法のバリエーションは、植物の根と菌根6の間の相互作用を分析するために開発された。我々は今、Mの増殖に適合し、この方法を最適化していますtruncatula工場 。より一般的に使用される方法に勝るこのプロトコルの利点は、以下に説明する。 Mの根粒形成の研究のために現在広く用いられているいくつかの方法があります。 truncatula inocuSでlated メリロティ 7。節のある根の大規模調製のために最も一般的に使用される方法は、aeroponicケーソン7の成長である。この方法では、植物は、大血管上に懸架され、根はS.の混合物で通気されている根粒と栄養溶液7。この方法は現実的であるかのSの唯一の遺伝子型根粒は、テストされる。それは細菌の高濃度のエアロゾル化を必要とするため、異なる細菌株を接種したケーソンの間の交差汚染の可能性が高い。多くの場合、接種した植物を大量に調製するために使用される別の方法は、浴槽またはパーライト、バーミキュライト、砂または栄養溶液を注入し、S.を接種された焼成粘土の鉢で成長であるメリロティ 7。このメソッドは、開いている桶やポットの使用を必要とし、栄養溶液の水やりや補充が必要です。ポットの別の欠点は、植物のことである根や結節の検査のために、この粒子状マトリックスから削除する必要があります。この方法の別の欠点は、ときに、多くの異なるS.インキュベーター空間の大きな領域が必要とされることである別個の鍋は、各細菌の遺伝子型のために使用しなければならないので、 メリロティ遺伝子型は、比較される。 「レナードジャー」は、この方法で8,9のバリエーションです。レナードジャーは、他の上に1を積層して芯で接続された2つの滅菌の容器で構成されている。増殖培地を下部容器に入れ、パーライト、バーミキュライト、砂、上部容器中の焼成粘土の成長マトリックス中に毛管作用によって芯を通って引き込まれる。苗（単数または複数）は、成長マトリックス中に入れ、S.を接種するメリロティ 。この方法は、水やりは必要ありませんが、根や結節の検査では、苗が粒子状の成長マトリックスから削除されている必要があります。 カンガルーの簡単な検査を可能にするか、いくつかの方法がありますTS。これらの一つは、透明なプラスチックの「成長パウチ」7である。この方法の欠点は、≤10ミリリットルの液体媒体はM.を成長させるために最適であるので、頻繁な散水が必要とされることである小袋7 truncatula。ポーチ実験はまた、通常のため、ポーチ内の紙芯の内訳を、〜2週間7に限定されている。一般的に使用される2つの他の方法は、植物を寒天上で増殖させ、根が見えるされていることに我々の手法と同様であるが、これらの方法はまた、我々の手順が回避される欠点を有する。これらの方法では、植物は完全に24.5センチメートル多孔サージカルテープでトップの周りに密封された、または綿のプラグまたはプラスチック製のキャップ7で栓を寒天スラント試験管で栽培X 24.5センチメートル寒天プレート内に含まれています。これらの方法はいずれも、根の容易な検査を可能にし、無菌に保つことができる。しかし、寒天斜面管は通常、媒体7寒天のみ20ミリリットルで増殖させ、水やりと栄養A必要植物の長期的な成長のためにddition。 24.5センチメートルX 24.5センチメートル内寒天平板マイクロコズムを成長した植物は、長期的な成長のために十分な水分と栄養を持っていますが、根粒7を阻害する構築することができ、成長のシュートを速やかに囲まれたプレート縮図とエチレンガス内に拘束になる。ここで説明する手順では、シュートを露出させ、長期的な成長を可能にするメディアの〜70ミリリットルが含まれている小宇宙の外に自由に成長する。 ここで説明する手順は、マメ科植物の根粒形成の研究のためだけでなく、他の中型植物の根の表現型の研究のためだけでなく、有用であり得る。これらの小宇宙と伝統的なポリカーボネートの植物組織培養瓶の違いは、ここで説明するプレートマイクロコズムにおける根がダウンジャーの底に寒天の水平層に寒天の垂直面上に成長ではなく、ということです。これは、ルートは、最小のdの寒天表面から持ち上げられることを可能にする根毛や顕微鏡によって根毛の検査を容易に根表面に寒天の最小付着amage。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agar purified, plant cell culture-tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single-plant, sterile microcosms for nodulation and growth of the legume plant medicago truncatula with the rhizobial symbiont sinorhizobium meliloti

根粒菌は、互換性のあるホストマメ科植物の根に共生窒素固定根粒を形成している。これらの相互作用を研究するための最もよく発達したモデル系の一つは、 ウマゴヤシの履歴書をtruncatula植物です。 Jemalong A17と根粒細菌シノリゾビウムは 1021 メリロティ 。植物の根と共生の表現型のスコアリングを繰り返しイメージングは​​、植物や細菌のいずれかに非破壊的な方法を必要とします。いくつかの植物や細菌の突然変異体の共生表現型は、成長の比較的短い期間の後に明らかになると、ホスト/共生相互作用の長期観測を必要としません。彼らが得点する前にしかし、根粒形成過程の初期段階で明らかにならないの共生効率と結節老化の表現型の微妙な違いは、比較的長い成長期間が必要。いくつかの方法がこのホスト/共生対の長期成長および観察のために開発されている。しかしながら、これらの方法の多くは、他の微生物による汚染の可能性を増大させる繰り返し散水を必要とする。他の方法は、植物の多数の成長のために比較的大きなスペースを必要とする。ここで説明する方法、Mの共生成長truncatula / S滅菌された単一の植物マイクロコズムにおける根粒は 、いくつかの利点があります。これらのマイクロコズム中の植物はその水やりは水やりの際に交差汚染を防ぐ、最大9週間のために必要されていないことを確認するのに十分な水分と栄養を持っている。これは表現型は、結節の開発と早期結節老化の微妙な遅延などの短期的な成長システムに見逃される可能性のある定量化することができます。必要とされていないアップ発根観察のための植物のようにも、小宇宙をルーツと結節が容易に、プレートのふたを通して見ている。

これらのプレートマイクロコズムの調製及び接種は、冒頭で説明した大部分の他の方法に比べて比較的単純である。これらの小宇宙の使用も水やりや栄養素の補給、ルート無菌性の維持、両方のルーツと光から根の保護を容易に検討することなく、（9週まで）延長された植物の成長を可能にし、植物の制約のない成長は、のために撮影して、簡単にアクセスを撃つ長さ測定、及び根毛への最...

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Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

標準的な実験プレートから作られた個々の滅菌マイクロコズムにおける窒素固定細菌シノリゾビウム根粒との共生におけるウマゴヤシtruncatulaの植物の成長は、無菌性を損なうことなく、根系や結節の頻繁な検査を可能にします。植物は、最大9週間、これらの成長チャンバー内に維持することができる。

根粒とマメ科植物の成長のための単一の植物、滅菌マイクロコズム<em&gt;ウマゴヤシtruncatula</em&gt;根粒共生と<em&gt;シノリゾビウム根粒</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

16.9K ビュー.  Florida State University. 標準的な実験プレートから作られた個々の滅菌マイクロコズムにおける窒素固定細菌シノリゾビウム根粒との共生におけるウマゴヤシtruncatulaの植物の成長は、無菌性を損なうことなく、根系や結節の頻繁な検査を可能にします。植物は、最大9週間、これらの成長チャンバー内に維持することができる。 

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

環境学

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

師部ふるい要素に電気信号を取得し、測定するための電気浸透グラフ（EPG）の新しいアプリケーション

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

マチ付きThermogradient表は、植物の成長を評価し、土壌プロセスの監視のための土壌の温度を制御します

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone as a cheap and readily available CO2 sorbent. While the technology has been widely studied, there are a few available options that could be applied to make it more economically viable. One of these is to increase the oxygen concentration in the calciner to reduce or eliminate the amount of recycled gas (CO2, H2O and impurities); therefore, decreasing or removing the energy necessary to heat the recycled gas stream. Moreover, there is a resulting increase in the energy input due to the change in the combustion intensity; this energy is used to enable the endothermic calcination reaction to occur in the absence of recycled flue gases. This paper presents the operation and first results of a CaL pilot plant with 100% oxygen combustion of natural gas in the calciner. The gas coming into the carbonator was a simulated flue gas from a coal-fired power plant or cement industry. Several limestone particle size distributions are also tested to further explore the effect of this parameter on the overall performance of this operating mode. The configuration of the reactor system, the operating procedures, and the results are described in detail in this paper. The reactor showed good hydrodynamic stability and stable CO2 capture, with capture efficiencies of up to 70% with a gas mixture simulating the flue gas of a coal-fired power plant.

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

This manuscript describes a procedure for operating a calcium looping pilot-plant for post-combustion carbon capture with high oxygen concentrations in the calciner in order to reduce or eliminate the flue gas recycle.

25 KW回カルシウム ループ パイロット-を持つ植物、Calciner で高酸素濃度の操作

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

窒素酸化物ガスで害虫駆除のため研究所くん蒸処理の手順

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

無菌状態で小さな分子に対する植物の反応を評価するための柔軟な低コスト化の養液栽培システム

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

根の生長およびローカライズされた栄養素に対する反応性を可視化する最適化された Rhizobox プロトコル

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...