この方法は、エレクトロニクスの専門知識を持たない個人が、分子診断に不可欠な等温核酸増幅および検出のために、この蛍光計のような機器を構築することを可能にします。この技術の主な利点は、システムが低コストで、市販の材料やオープンソースソフトウェアから完全に組み立てることができるということです。この蛍光計は、複数の等温増幅法で使用できます。
これは、感染性および遺伝性疾患の広い範囲を検出するために、等温増幅法がますます使用されているため、重要です。光学ハウジングを組み立てるには、光学エンクロージャー底部STLピースの上の穴に3/16インチの長い4-40ネジインサートを配置し、1/4インチの長い4-40ネジインサートをピースの他のすべての穴に配置します。中央テストボードをハウジングの上部キャビティに挿入し、5本のピンをデバイスの中心軸に向けて最も近く向け、3/16インチの長さ4-40ネジでテストボードを固定します。
20 ミリの焦点距離レンズの 1 つを、凸面側をデバイスの底面に向けてテストボードから離れた位置にある中央テストボードの下のセクションに置きます。最初の構成を作成するには、長いパスフィルターを 20 ミリの焦点距離レンズの下の次のセクションに配置します。2 番目の構成を作成するには、レンズの下のセクションに 2 つの黄色のエミッション フィルターホイルを配置します。
最初の構成を作成するには、製造元が指定したフィルターの向きを観察しながら、ダイクロアスミラーを包みの中心近くの斜めのセクションに配置します。2 番目のコンフィギュレーションを作成するには、梁分割線を対角断面に配置します。構成に応じて、2番目の20ミリメートル焦点距離レンズを、構成に応じて二色性ミラーまたはビームスプリッターの下のセクションに配置し、凸側をデバイスの上部に向けます。
最初の構成を作成するには、励起フィルタを二色性鏡の右側のセクションに配置し、矢印が二色性鏡に向かっていることを確認します。2 番目の構成を作成するには、1 つの青い励振フィルターホイルをビーム スプリッターの右側のセクションに配置します。15ミリの焦点距離レンズを励起フィルタの右側に置き、凸側を二色鏡に向けて配置します。
また、LEDをダイクロアックミラーまたはビームスプリッターに向けて印刷物の残りの部分に配置します(設定に応じて)。LEDからリードする2本のワイヤが凹部チャンネルに挿入され、印刷がしっかりと閉じられるようにします。3Dプリントピースの反対側の設定を繰り返します。
次に、エンケースの上半分の押し出し部分を、エンケースの下半分の凹んだ溝に入れ、光学部品でピースの空面を閉じます。そして3/8インチの長い4-40のねじと一緒に部品を固定します。電子機器とタッチスクリーンを組み立てるには、2つのミニブレッドボードを接続し、マイクロコントローラをブレッドボードの1つに配置して、マイクロコントローラのマイクロUSBポートが外側に向かっていることを確認します。
LED変調を接続するには、LED+ドライバのCTLピンをマイクロコントローラのデジタルピンに接続します。そして、LEDドライバのLEDピンをマイクロコントローラのGNDピンに接続します。ブレッドボードの裏面にあるプラスチックカバーを取り外し、ブレッドボードの粘着箱を3Dプリント部分に押し付け、LCDスクリーンホルダーSTLプリント部分の裏側部分の内側に組み合わせ式のブレッドボードを取り付けます。
1インチの長さ4-40ネジで、光学エンクロージャー内に組み立てられたブレッドボードでLCDスクリーンホルダーを固定します。LED 電源装置を接続するには、LED ドライバーの LED プラスピンを最初の LED の正のワイヤーに接続します。そして、最初のLEDの負のワイヤーをブレッドボードの2番目のLEDの正のワイヤーに接続します。
2 番目の LED の負の線を LED ドライバの LED ピンに接続します。LED 電源モジュールを接続するには、2 ピン アダプタにバレル ジャックを使用して、10 ボルト電源の正と負の線を LED ドライバの VIN+ピンと VIN ピンに接続します。センサーテストボードの電源とデータ転送を接続するには、4ピンメスから男性のジャンパーワイヤーを使用して、ライトデジタルセンサーテストボードのSCK、SDA、VDUT、GNDピンを、LCDホルダー印刷物の右上の隙間を通してミニブレッドボードに接続します。
ブレッドボードで、マイクロコントローラの3.3ボルトピンと両方のテストボードのVDUTピン、マイクロコントローラのGNDピン、および両方のテストボードのGNDピン、マイクロコントローラのアナログ4ピン、および両方のテストボードのSDAピン、およびマイクロコントローラのアナログ5ピンが存在することを確認します。、両方のテストボードのSCKピンがすべて接続されています。4 本の M2.5 ネジを使用して、単一ボード コンピュータの HDMI ポートと電源アダプタ ポートを上向きにし、3D プリントパーツを中心に 1 台のボード コンピュータを LCD 画面ホルダーに固定します。その後、タッチスクリーンの指示に従って、タッチスクリーンディスプレイをシングルボードコンピュータに接続します。
そして、タッチスクリーンのHDMIポートにシングルボードコンピュータのHDMIポートを接続します。リアルタイム蛍光データを記録するには、ヒートブロックがオンになって適切な温度に達した後、単一ボードコンピュータの電源を入れ、マイクロUSBからUSBケーブルを使用して、シングルボードコンピュータをマイクロコントローラに接続します。タッチスクリーン上で提供されている Python スクリプトを開き、測定時間を変更します。
変数出力ファイルのパスを、プログラムが生成するデータ ファイルの名前に変更します。シリアル ポート変数を目的の値に変更します。監視する反応を含む2本のPCRチューブをヒートブロックに入れます。
また、各光チャネルから押し出す4つのペグの間を中心にPCRチューブを持つヒートブロックにフルオリメーターを置きます。3D プリントされた蛍光計が接続されていることを確認したら、LED の電源アダプタを接続して Python プログラムを起動します。両方の PCR チューブでリアルタイム蛍光を測定するためのグラフィカル ユーザー インターフェイスが LCD 画面に表示されます。
実験の最後に、ユーザー定義の場所に保存された測定値と出力データ ファイルを表示します。一度組み立てられると、FITC染料の希釈シリーズからの蛍光を測定することによって、蛍光計の性能を検証することができる。この代表的な分析では、フルオリメーターの両方のチャネルが所望の範囲にわたって線形応答を示した。
ここに示されているリコンビナーゼポリメラーゼ増幅陽性のベースライン減蛍光と、フッ素計の第2構成で測定された標準的な市販キットの陰性対照反応を示す。フルオリメーターの最初の構成でSARS-COVID-2 RNAに対するカスタム逆転写ループ媒介等温増幅反応のリアルタイム蛍光測定は、臨床的に関連するRNAコピー数の範囲にわたって期待通りに増幅が起こることを示している。世界的なサプライチェーンが非常にストレスを受けている時期に、この蛍光計のような機器のオープンソース部分は、パンデミックに関連する健康格差の一部を減らすのに役立ちます。
