InDevRはこの作業に資金をNIH / NIAID U01AI070276とR43AI077112を認めている。

1。 RT - PCRを用いたサンプルの増幅<ol><li>臨床材料やQIAcube自動核酸抽出のプラットフォームと組み合わせてキアゲンアプライウイルスのスピンのキットを用いてウイルス分離体からウイルスRNAを抽出する。抽出物を60μlの最終的な溶出容量で200μlの試料上で実行されます。 -70ストア抽出° Cまたは後で使用するために低い。 </li><li>テンプレートのフリーエリアでは、製造業者のプロトコールに従って氷上でRT - PCRマスターミックスを調製する。 RT - PCR中にビオチンを組み込むには、dNTPミックス供給メーカーの代わりにビオチン化dNTP混合物を使用してください。ビオチン化dNTP混合物を使用してのコストは1ドル未満USD /アッセイである。ビオチン化プライマーの使用などのビオチン取り込みの代替方法も使用することができます。インフルエンザのための1.0μMの最終濃度が、インフルエンザBが1.0μM、及び内部統制のための0.14μMのプライマーミックスを追加。インフルエンザは、プライマーセットは、マトリックスの遺伝子のセグメント（1032 ntの製品）を増幅し、インフルエンザBのプライマーセットは、非構造遺伝子のセグメント（811 ntの製品）を増幅する。各FluChipのプライマーセットは、PCR以下のラムダエキソヌクレアーゼによる酵素消化を経由して一本鎖DNAの生成を容易にするために5&#39;リン酸基を持つ一つのプライマーが含まれています。結果として得られる一本鎖生成物は、二本鎖同等よりはるかに短いハイブリダイゼーションの時間を必要とし、大幅に全体的なアッセイ時間を短縮。これらのプライマーの事前準備混合物だけでなく、内部統制テンプレートRNAはInDevRから限定的に関心のある研究者に利用可能です。 </li><li>簡単に言うと渦と薄壁PCRチューブにマスターミックス18μlを配布する。 </li><li>テンプレートを追加するための適切な作業エリアにチューブを氷中に移し、そして各反応チューブに2μlのテンプレートを追加します。 </li><li>サーマルサイクラー、および以下の温度プロファイルの実行に転送PCRチューブ：50で逆転写反応を95℃で30分間、酵素不活性化/活性化のためのCで15分間、30秒95℃、40回のPCRサイクル、55 C ° 30代のためのC、および72℃1分間、および10分間72℃で、最終的な拡張のためのC。 </li></ol> 2。低密度マイクロアレイ、RT - PCR産物のハイブリダイゼーション<ol><li> FluChipのハイブリダイゼーションのための一本鎖DNAを生成するために、1.0μLラムダエキソヌクレアーゼ酵素、付属の反応バッファー2.2μL、およびヌクレアーゼフリー水0.8μlを組み合わせることにより、酵素消化混合物を準備する。これらの金額は、単一のサンプル用ですが、単に消化するサンプルの総数に比例してスケールアップすることができます。サーマルサイクラーからサンプルを削除し、PCR産物のリン酸化鎖を消化するために、各反応に調製された混合物の4μlを加える。サーマルサイクラーやプログラム酵素消化し、熱の断片化のステップを完了するために10分間摂氏95度に続いて15分間37℃にサーマルサイクラーにサンプルを返します。 </li><li>使用されるカスタムインフルエンザマイクロアレイを応用マイクロアレイ株式会社（テンペ、アリゾナ州）でアルデヒド官能化されたガラススライドに印刷されています。 5&#39; -アミノ終端キャプチャシーケンスは、（さらに3&#39; -ビオチン修飾を持っているし、500nMの最終濃度でスポットされている正の制御シーケンスを除く）に最適化されたスポッティングバッファーと組み合わせると20μMの最終濃度で印刷されています。方法をスポッティング非接触は300μmおよび700μmの中央のピッチへの中心の最適なスポット径で、使用されています。 </li><li>収納ボックスから、マイクロアレイを削除し、保護シートを取り除き、よく周囲をしっかりと押して、マイクロアレイの周りに、シングルユースのハイブリダイゼーションの井戸を適用します。 </li><li> 60〜90 rpmでオービタルシェーカーを使用して5分​​間プレハイブリダイゼーションの洗浄のために精製水110 mlを入れた洗浄ビンに配置してスライド。優しくものエッジに組織のワイパーに触れると水が離れて邪悪できるようにすることで配列を乾かします。 </li><li>断片化したssDNAの製品のそれぞれで2倍のハイブリダイゼーション緩衝液22μlを組み合わせて、ピペットマイクロアレイのウェルにハイブリダイゼーション溶液の40μlの。 </li><li>スライドを60分間閉鎖湿度チャンバ内でハイブリダイズすることができます。 </li><li>湿度チャンバーからスライドを削除し、簡単にスライドをラックに配置する前にリンスボトルの洗浄緩衝液Dでアレイをすすいでください。一般的にWash BufferをDの洗浄量は、配列あたり2 mlである。 1分間60から90 rpmでオービタルシェーカーの110 mlの洗浄バッファーA.プレイスのビンを含む洗浄ビンでスライドを含む場所のスライドラック。 </li><li>洗浄バッファーでスライドラックを削除する、簡単に洗浄緩衝液D、洗浄緩衝液Bを含むビンへの転送のスライドラックで洗い流し、そして5分間60〜90 rpmで振とうする。 </li><li>ゆっくりと各スライド上にアレイを乾燥させ、そしてampliPHOX比色検出ステップの準備のために湿度チャンバ内で乾燥させたスライドを配置する。 </li></ol> 3。 ampliPHOX：ampliTAGでハイブリダイズ製品およびキャリブレーションチップのラベリング<ol><li>組み合わせる<html> ampliTAG10μlの、2倍ampliTAGの緩衝液20μl、および処理される各配列に対して精製水10μlの。試薬容量は、単純にサンプルの合計数に比例してスケールアップすることができます。必要なすべてのサンプルの配列およびキャリブレーションの配列を考慮して十分なラベリング混合物を調製することを確認してください。必要に応じてキャリブレーションチップの数は、完全なキャリブレーション（新しい楽器や試薬の新しいロットの場合）、または単に楽器のチェックを実行しているかどうかによって異なります。完全なキャリブレーションのために、3キャリブレーションチップがラベルされて、および試薬のチェックのために、ちょうど単一のキャリブレーションチップはラベル付けされるべきである。キャリブレーション配列がラベル付けされる前に、彼らは以前にインフルエンザの配列のために説明したプレハイブリダイゼーションの洗浄工程を経る必要があることに注意してください。 </li><li>各アレイにラベルの混合物の40μlを移し、5分間密閉湿度チャンバ内で進行する反応にラベルを付けることができます。 </li><li>すぐにスライドをラックにスライドを配置する前にリンスボトルの洗浄緩衝液Dでアレイをすすいでください。 Wash BufferをCの110 mlを入れたビンにラックを移し、5分間60〜90 rpmで振とうする。 </li><li>精製水で満たされた回目の洗浄ビンを用いて、塩の残留物を除去する3つの連続した​​短い水のディップを実行します。優しく井戸の縁に組織のワイパーに触れることによって配列を乾かします。 </li><li>マイクロアレイは、正しくampliTAGで標識されている、とampliPHOX検出手順の残りを行うことができます。ラベルの付いた配列の光活性化とイメージングは​​、24時間以内に終了してください、と追加の配列は使用時まで暗いスライドボックスに格納することができます。 </li></ol> 4。 ampliPHOX：キャリブレーション、信号増幅、およびイメージング<ol><li> ampliPHOXリーダーの電源をONにしてampliVIEWのソフトウェアは、光活性化のための準備ができていることを確認してください。 </li><li>キャリブレーションのチップを使用して、最適な光活性化の時間を決定します。以下の簡単な紹介に加えて、この手順もampliPHOXのオペレーションマニュアルで詳しく説明されています。キャリブレーションチップは、ソフトウェアによって決定される正の信号を生成するキャリブレーションチップの行数の最大化を目標に、アッセイの感度を最適化するために利用されるビオチン化制御シーケンスの希釈系列を含んでいます。 </li><li> 4からampliPHYを取り除く° C、室温に戻して、そしてミックスに簡単に渦。あるいは3 ampliPHYバイアルにampliPHYエンハンサーの添加、10秒間十分にボルテックス。 </li><li>均等に気泡が存在しないことを確実に、よくampliTAG標識配列を含むマイクロアレイにampliPHY溶液40μLを転送する。各アプリケーション間ampliPHYバイアルを閉じます。 ampliPHOXのリーダーの光活性化のベイにマイクロアレイスライドを挿入します。 </li><li>最初のキャリブレーション配列の場合は、ソフトウェアの左側のパネルで&quot;時間&quot;ボックスに、既定の光活性化の時間を使用し、光活性化を開始するために緑色の&quot;スタート&quot;ボタンをクリックしてください。完了すると、アレイを削除し、過剰ampliPHYを除去する精製水ですすいでください。スポットのいくつかについて明確なポリマーの形成が表示されるようになるはずです。 </li><li>ポリマーのスポットが配列にampliREDの2滴を配布し、2分間乾燥させ、2分間進行染色できるようにすることができます。 </li><li>次に、速やかに水とティッシュペーパーで乾燥して精製したマイクロアレイすすいでください。 </li><li> ampliPHOXリーダーのイメージングベイにマイクロアレイを挿入し、[印刷品質]タブで&quot;キャプチャ新規イメージ&quot;ボタンをクリックしてください。一度イメージを作成、作物を調整して画像を保存する。 </li><li> [分析]タブでは、分析を開始するためにキャリブレーションチップのマスクと&quot;自動配置&quot;ボタンをクリックします。ソフトウェアは自動的に定量結果を示す&quot;サマリーレコード&quot;を生成します。これらの結果に基づいて、光活性化の時間は、番目の校正の配列のために10秒で調整され、手順が繰り返されます。 </li><li> optimal光活性化の時間が決定されると、サンプルの配列は、キャリブレーションの配列に使用されるのと同じ信号の増幅およびイメージングプロトコルを使用して処理することができます。 </li><li>いったん画像がサンプルの配列のためにキャプチャされ、インフルエンザの配列のレイアウトは、ここで説明するような、特定の配列のレイアウトのためのマスクはcreated.The ampliVIEWのソフトウェアは、自動画像分析を実行し、各サンプルのインフルエンザサブタイピング結果を生成することができるとすることができます。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。ampliPHOX比色検出法の模式図。 （A）ビオチン化ターゲットDNAは、配列内の各スポットにハイブリダイズされ、そして（B）ampliTAGで標識。 （C）ampliPHY溶液を添加し、（D）目に見えるポリマーのスポットを形成するために光にさらされる。 （E）に形成されたポリマーのスポットが続いてコントラストを向上させるために、非毒性の色素で染色されています。 ontent&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="図2"/> 図2（A）インフルエンザの低密度マイクロアレイのレイアウト。シーケンス1-7と10から13までのターゲットインフルエンザ、およびシーケンス8,9ターゲットインフルエンザB.（B）ampliPHOXとの両方で同一の検出パターンを示す2009年新型H1N1（&quot;豚インフルエンザ&quot;）標本の（C）蛍光画像方法。 <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="図3"/> 図3左からインフルエンザH3N2、ヒト起源H1N1、2009年新型H1N1（豚由来）、および負の試料のための右の、代表的なampliPHOXイメージに。すべての3つのサブタイプは、アレイ上で視覚的に明確なパターンを示す。のみMS2内部統制が、RT - PCRの増幅が阻害されなかったことを示す、見ていることを否定的に注意してください。

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E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology.">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li><li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

著者のすべてはInDevR、（株）、非営利のエンティティの従業員です。 InDevRは、本明細書に記載ampliPHOX技術を商業化されています。

ここで紹介するampliPHOX比色検出技術は、低密度マイクロアレイのアプリケーション用の単一のカラー蛍光検出に迅速に、安価な代替品です。 図1に模式的に示すように、検出原理は、光開始剤のラベルを使用する（1B）に基づいています。モノマー含有溶液（1C）、光照射の存在下で光重合開始剤（ampliTAGが）のみというラベルの領域（1D）の重合反応をトリガします。インフルエ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置</th><th>メーカー</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td>キアゲンアプライウイルススピンキット</td><td>キアゲン</td><td> 57704 </td><td>シングル60μlの溶出</td></tr><tr><td> QIAcube </td><td>キアゲン</td><td> 9001292 </td><td>オプション</td></tr><tr><td> ABI 9800高速サーマルサイクラー</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲンワンステップRT - PCRキット</td><td>キアゲン</td><td> 210210 </td><td>キットには使用しないdNTPの</td></tr><tr><td> 2倍のスポッティングバッファー</td><td> InDevR株式会社</td><td> MI - 5007 </td><td></td></tr><tr><td>ビオチンのdNTPミックス</td><td> InDevR株式会社</td><td> MI - 5009 </td><td></td></tr><tr><td>ラムダエキソヌクレアーゼ</td><td>シャーロットのバイオテクノロジー</td><td> LE032K </td><td> 2500年U、10U/μl </td></tr><tr><td> FluChipのプライマーミックス</td><td> InDevR </td><td> N / </td><td>販売はまだ利用できません</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td> Madellテクノロジー</td><td> ZD - 9556 - </td><td></td></tr><tr><td>ビンを洗う</td><td> InDevR株式会社</td><td> MI - 4002 </td><td></td></tr><tr><td>ラックを洗う</td><td> InDevR株式会社</td><td> MI - 4003 </td><td></td></tr><tr><td> 2倍のハイブリダイゼーションバッファー</td><td> InDevR株式会社</td><td> MI - 5004 </td><td></td></tr><tr><td>キャリブレーションチップス</td><td> InDevR株式会社</td><td> AP - 5006 </td><td></td></tr><tr><td>バッファのADを洗う</td><td> InDevR株式会社</td><td> MI - 5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR株式会社</td><td> AP - 5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR株式会社</td><td> AP - 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2倍ampliTAGバッファ</td><td> InDevR株式会社</td><td> AP - 5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY、ampliPHYエンハンサー</td><td> InDevR株式会社</td><td> AP - 5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNAマイクロアレイは、病原体検出のための強力なツールとして浮上している。たとえば1-5、タイプとサブタイプのインフルエンザウイルスへの能力の多くの例が実証されている。6-11インフルエンザの同定およびサブタイピング、DNAマイクロアレイ上の両方の公共のアプリケーションを持っている健康と早期発見、迅速な介入、およびインフルエンザのパンデミックの影響を最小限に抑えるためのクリニック。従来の蛍光は、現在最も一般的に使用されるマイクロアレイの検出方法です。マイクロアレイ技術は、臨床使用に向けて進むにつれ、しかし、、1は蛍光に同様のパフォーマンス特性を発揮する低コストの検出技術と高価な計測機器を取り替えたりするとマイクロアレイアッセイをより魅力的で費用対効果になります。 ampliPHOX比色検出技術は、研究のアプリケーションを対象とし、そして蛍光マイクロアレイに必要な共焦点マイクロアレイスキャナに比べておおよそ十倍低い楽器のコストが主な利点と、従来の蛍光11の一桁内での検出限界を有している検出。もう一つの利点は、従来の蛍光器具と異なり、移植性と柔軟性を可能にする機器のコンパクトサイズです。重合技術は、蛍光検出のように本質的にリニアではないので、しかし、それは最高のような病原体検出アレイなどの特定配列の存在のYes /無応答が望まれる低密度マイクロアレイのアプリケーションに最適です。現在ampliPHOXの検出と互換性のある最高のスポットの密度は〜1800スポット/配列です。理由スポット密度の制限により、高密度マイクロアレイはampliPHOXの検出には適していません。 ここで、我々は、インフルエンザウイルスの検出と特性評価（FluChip）用に開発された低密度マイクロアレイ上での信号増幅の方法としてampliPHOX比色検出の技術を提示する。このプロトコルはampliPHOX検出の一つの具体的なアプリケーションとしてFluChip（DNAマイクロアレイ）を使用していますが、ビオチン化ターゲットを搭載したあらゆるマイクロアレイは、同様の方法で標識し、検出することができます。キャプチャする対象のマイクロアレイの設計とビオチン化は、ユーザーの責任です。ビオチン化したターゲットが、アレイ上に捕捉されると、ampliPHOXの検出は、最初にタグ付けすることにより、ストレプトアビジン標識コンジュゲート（ampliTAG）を持つ配列を行うことができます。モノマー溶液のampliPHOX Readerのインストゥルメント、重合を用いて、露光時に（ampliPHY）ampliTAG標識ターゲットを含む地域でのみ発生します。形成されたポリマーは、その後、簡単なソフトウェアパッケージ（ampliVIEW）を使用したイメージングと解析に続いて視覚的なコントラストを向上させるために、非毒性の溶液で染色することができます。起因する非抽出サンプルから全体FluChipアッセイは約6時間で行うことができ、上述のampliPHOX検出ステップは、約30分で完了することができます。

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX比色検出技術は、マイクロアレイの蛍光検出に安価な代替手段として提示されます。光重合に基づいて、ampliPHOXはわずか数分で肉眼で見える固体高分子スポットを生成します。結果はシンプルかつ強力なソフトウェアパッケージと一緒にして撮像し、自動的に解釈されます。

インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K ビュー.  InDevR Inc.. ampliPHOX比色検出技術は、マイクロアレイの蛍光検出に安価な代替手段として提示されます。光重合に基づいて、ampliPHOXはわずか数分で肉眼で見える固体高分子スポットを生成します。結果はシンプルかつ強力なソフトウェアパッケージと一緒にして撮像し、自動的に解釈されます。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...