核磁気共鳴研究を行っています。これにより、溶液中のタンパク質、RNA、DNAの構造を決定することができます。これらの生体分子は構成成分であり、細胞の構成要素であり、ここで提示するプロトコルは、低分子のスクリーニングとこれらの標的への結合に関係しています。
これらの分子から、私たちの創薬化学や構造生物学は、病気と戦う新薬を導き出すことができます。私たちの技術の主な利点は、タンパク質などの分子標的の品質を完全に制御できること、低分子フラグメントや薬物の品質を完全に制御できること、および幅広い親和性の結合についてタンパク質をスクリーニングできることであり、これは他の方法論と比較して利点です。NMR測定用のスクリーンサンプルを調製するには、サンプル調製ロボットを使用して768化合物を8つの96ウェルプレートに分配し、12個のフラグメントを含む64個の混合物を混合物あたり最終濃度4.2ミリモルにします。
適切なスクリーニングバッファーで希釈した目的の生体分子ターゲットを、適切な数のバーコード化された3ミリメートルNMRハイスループットサンプルチェンジャーチューブに移し、ロボットを使用して、各リガンド混合物10マイクロリットルをターゲット生体分子の各チューブに移します。次に、ロボットに溶液を完全に混合させます。NMR取得の場合は、サンプルを分光器にロードします。
分光器ソフトウェアを開き、リガンドベースの実験用のパラメータセットとパルスシーケンスを選択します。リストされているすべての実験で、水抑制として励起スカルプティングを選択します。フッ素-19スクリーニングでは、1D実験とT2実験の両方を選択します。
スペクトル幅を220ppmに、励起周波数を140ppmに、分析時間を1〜5時間に選択します。T2の場合、CPMG時間は5〜100ミリ秒の間で交互に行われる必要があります。T1rおよびT2実験を記録します。
飽和伝達差を擬似2Dとして記録します。2つの単一の1Dスペクトルを処理するには、リラックスオプションの有無にかかわらず、AUプログラムのProcStd関数を使用します。WaterLOGSYは単一の1Dであり、溶媒信号に対して負の位相でフェーズする必要があります。
水素スクリーニングデータを解析するには、フラグメントベースのスクリーニングツールの指示に従って、スクリーニングキャンペーンからの生体分子磁気共鳴NMRデータを保存し、各スクリーニング混合物のディレクトリに、サンプルで測定されたさまざまな実験を含むサブディレクトリがあるようにします。参照スペクトルを保存し、生体分子ターゲットなしでサンプルから保存されたすべてのデータを保持しますが、混合物と単一の化合物は異なるディレクトリに保存されます。集録データを含むディレクトリへの直接パスを作成し、すべての混合物が個別のディレクトリを持つNMRディレクトリを選択します。
CSV、フラグメントスクリーン、XML ドキュメント、および BAC ファイルもデータの NMR ディレクトリにコピーされていることを確認します。スクリーニングされたサンプルに対してフラグメントベースのスクリーニングツールを使用するには、フラグメントベースのスクリーニングプロジェクトのシンボルを解析ウィンドウの中央にドラッグします。このシンボルは、以前に保存したデータセットがコピーされた場合に表示されます。
フラグメントベースのスクリーニングオプションウィンドウが自動的に開きます。ミックスの名前、各フラグメントの名前、および各フラグメントのミックスへの分割を含む CSV カクテルファイルを選択します。単一フラグメントのすべての測定スペクトルを含む参照リガンドスペクトルフォルダーを定義し、通常、調査対象のターゲットを含まないミックスのデータセットを含む参照ブランク実験フォルダーを定義します。
調査対象のスペクトルとスペクトル表示色を定義するには、[スペクトル タイプ]タブを開き、プロセス データに従ってスペック タイプを設定します。[表示レイアウト]タブで、スペック タイプに従って比較するスペクトルを定義します。次に、[OK] をクリックしてプロジェクトを開始します。
データの処理中は、すべてのカクテルミックスと各ミックスのリガンドをまとめたテーブルを含む別のウィンドウが開きます。セルをダブルクリックして、それぞれのデータセットを開きます。バインダーを割り当てる前に、基準ピークが互いに一致し、同じ化学シフトを持っていることを確認してください。
相違が見られる場合は、[プロセス]タブを開き、シリアル処理オプションを使用して修正します。フッ素-19混合物の最初の分析では、[分析]タブを開き、積分関数を選択します。対応するフッ素-19シグナルの明確な集積領域が混合物中の各フラグメントに対して定義されていることを確認します。
エクスポート統合リージョンを保存して、将来使用するために統合ファイルをエクスポートし、使用済みの統合ファイルを適切なインストール・ディレクトリーに保存します。フッ素-19データの場合、調査対象のターゲットの有無にかかわらずデータセットを開き、[分析]タブで[統合]をクリックして[インポート統合領域を読み取り]をクリックして、対応する統合ファイルを現在のスペクトルにロードします。次に、「保存して戻る」をクリックして「積分」タブで統合領域のリストを見つけ、この情報を下流解析用のスプレッドシートにコピーします。
フラグメントライブラリ内のリガンドの分子構造または構成は、示されているように分子信頼度ソフトウェアを使用して分析され、結果はグラフ出力として表示されます。オレンジ色は、フラグメントの構造または濃度に不一致があることを示します。緑色のウェルは、フラグメントが一貫していることを示します。
この代表的な分析では、社内ライブラリからの1つまたは数個のフッ素基を含む103個のフラグメントを、混合物あたり20〜21個のフラグメントの5つのミックスに分割しました。フッ素-19横緩和実験は、CPMGパルス列を適用した各混合物について測定されました。閾値は、これらの典型的なチアミンタンパク質チロシンキナーゼAおよびRNAスペクトルにおいて観察されるように、混合物中の結合剤、弱い結合剤、または非結合剤を定義するのに有用である。
この代表的な分析では、ヒットワンは約50%のT2減少と6ヘルツ以上の化学シフトを示しました。WaterLOGSYは、陽性としてカウントされるシグナルに有意な変化を示さなかった。ただし、3つの実験のうち2つが肯定的であったため、このフラグメントはヒットとしてカウントされました。
ヒット2では、T2は信号強度で約80%の減少を示しました。ウォーターログスについても明確な信号変化が見られました。この実験では化学シフトは十分ではありませんでしたが、前の2つの基準が肯定的であったため、それでもヒットとしてカウントされました。
このような方法の最終的な目標は、酵素などの新薬や高親和性阻害剤を開発することであり、この中で、医薬品化学がこれらの新しい分子を引き継いで合成しますが、構造生物学、ここで適用する技術は医薬品化学を導き、そのアプローチをより速くすることができます。
