このプロトコルは、核酸プローブに特化していない研究者にとっても、ヌクレアーゼ活性を疾患のバイオマーカーとしてスクリーニングするための強力な代替手段を提供します。この技術の主な利点は、プローブヌクレアーゼの動的相互作用を利用して、既知および未知のヌクレアーゼの活動の両方を同定できる核酸プローブを選択できることである。この方法論の他の利点は、その柔軟性、高い再現性と使いやすさです。
デモンストレーションは、修士課程のカディヤと、研究室のポスドクであるバリスが行います。オリゴヌクレオチドライブラリーを設計する場合、アデニン、グアニン、シトシンおよびチアミンまたはウラシルの組み合わせを含む少なくとも1つのDNAおよび1つのRNAランダム配列が含まれる。オリゴヌクレオチドプローブを調製するには、凍結乾燥したオリゴヌクレオチドプローブをスピンダウンし、トリスEDTAバッファー内の各プローブをマイクロリットル当たり500ピコモラーで希釈し、ヌクレアーゼの分解を防ぎます。
固体培地上の細菌培養の場合、極低温貯蔵から単一の多孔質ガラスビーズを、脱脂羊の血液を補ったTSAを含む1つの培養皿に直接ロールし、個々の細菌コロニーをストリークアウトする。その後、プレートを摂氏37度に24時間置きます。液体培地中の細菌培養の場合、固体培地からTSBの50ミリリットルに単一コロニーを移し、毎分200回転で24時間摂氏37度でインキュベーションを行う。
翌日、新鮮なTSBで1〜500比で培養を希釈し、37°Cで24時間、1分あたり200回転の細菌を振度インキュベーターでインキュベートします。ヌクレアーゼ活性アッセイを設定するには、最初にフルオメーターを摂氏37度に予熱し、サルモネラまたは大腸菌液体培地培養物から96マイクロリットルの無菌TSBまたは上清をプローブあたり1つの1.5ミリリットル核アーゼフリーマイクロ遠心分離チューブに慎重に加える。各チューブに4マイクロリットルのプローブ作業溶液を加え、ピペットを使用して、均質な溶液が達成されるまで各チューブの内容物を完全に混合し、気泡を避けるように注意してください。
次に、各溶液の95マイクロリットルを黒底の個々の井戸の壁近くに慎重にロードし、非処理された96ウェルプレート、気泡を避けるように注意を払う。すべてのソリューションが追加されたら、プレートを覆い、測定アーティファクトを発生する可能性のあるペンマーキングやほこりがないか蓋を視覚的に検査します。ヌクレアーゼ活性測定用のソフトウェアをセットアップするには、適切な取得ソフトウェアプログラムを開きます。
[タスクマネージャ]ウィンドウから[今すぐ読み取り]を選択し、[新規]を選択して、キネティック測定プロトコルを作成します。[温度の設定] をクリックして摂氏 37 度を選択し、[OK] をクリックして設定を確認して保存します。[キネティクスの開始] をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、[実行時間] 入力ボックスで 2 時間、間隔入力ボックスで 2 分を選択してから、[OK] をクリックして設定を確認して保存します。
[読み取り] をクリックします。ポップアップウィンドウで、検出方法として蛍光強度を選択し、読み取りタイプとしてエンドポイントキネティックを、光学タイプとしてフィルタを選択します。次に、[OK] をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、[フィルター セット] から [緑] を選択し、[OK] をクリックします。[手順] ウィンドウで、[ふたを使用] を選択し、[検証] をクリックします。
作成したプロトコルが有効であることを確認するポップアップ ウィンドウが表示されます。[プロトコル] メニューの [プロシージャ] を選択します。「手順」ウィンドウで、測定するウェルを定義し、「ファイル名」入力ボックスに実験の名前を入力します。
次にプレートをプレートリーダーにロードし、プレートが正しい向きであることを確認し、[新しい読み取り]ボタンをクリックして取得を開始します。データ解析では、適切な解析ソフトウェアでデータを開き、プレート 1 つのウィンドウで測定されたウェルの 1 つを選択します。[ウェルを選択]をクリックし、[ウェル選択ダイアログ]ウィンドウに測定されたウェルをすべて含めた後で、[OK]をクリックします。次に、プレート 1 ウィンドウで [データ] を選択して集計結果を視覚化し、[クイック エクスポート] をクリックしてデータをスプレッドシートにエクスポートします。
スプレッドシートでは、各サンプルとプローブに適したデータ列にラベルを付け、データがキネティックグラフを生成する時間と相対的な蛍光単位をプロットします。この代表的な実験では、スクリーニングの最初のラウンドの後、サルモネラ培養上清はDNAプローブよりもRNAプローブの明確な好みを報告した。サルモネラヌクレアーゼによる好ましい核酸型としてのRNAの同定に基づいて、新しいRNAのみのライブラリーがスクリーニングの第2ラウンドで使用されるように設計されている。
対照的に、培養培地コントロールにおける大腸菌は、RNAプローブを分解する非常に限られた能力を示した。RNAプローブの特異性を高めることを目的とした化学修飾ヌクレオチドを用いた2回目のスクリーニングの後、RNAピリミジン2'O-メチルおよびRNAプリン2'O-メチルは、RNAピリミジン2'フルオロおよびRNAプリン2'フルオロと比較して最も優れた運動行動を示すとして、その化学的修飾に基づいて同定することができた。これらの結果は、サルモネラ菌が、この細菌を特異的に認識することができるプローブを選択するために使用できる、差動基質化学好みで重要なRNAAse活性を有することを示唆している。
この手順により、がんや細菌感染などの疾患状態に関連するヌクレアーゼ活性を同定できるプローブの選択が可能となり、新しい臨床診断ツールの開発が可能になります。
