サッカリバクテリアは、適切な宿主細菌との共培養を必要とする寄生虫です。ヒトの経口サッカリバクテリアとしては、既知の宿主細菌種を用いてほとんどの個体に対して容易に単離することができる。このプロトコルは、任意の研究者や研究室がバイナリコカルチャーで自分の株を分離することを可能にします。
この技術は、ほとんどの微生物学研究所に存在する単純な装置および装置を使用し、6種のサッカリバクテリアを表す30種以上の分離株を培養するのに成功した。このプロトコルは、適切なアクチノバクテリア宿主を同定し、単離できる場合、他の候補に従った放射線種、ならびに異なる環境および他の哺乳類からのサッカリバクテリアの単離に有用であり得る。この手順を実証することは、私の研究室の元博士研究員のアンドリュー・コリンズです。
まず、クモ膜プロピオンカなどの宿主菌の培養を開始し、早期定常期に成長するのに十分な時間を費やします。培養を開始するには、0.1%酵母エキスを含むトリプティック大豆ブロスを2~5ミリリットルにアラクニアプロピオンカで接種し、摂氏37度で24時間培養する。次に、トラックエッチング0.2マイクロメートルのフィルター膜を備えたフィルターホルダーを組み立てます。
ホイルで包み、遠心分離管とキャップアセンブリと一緒にオートクレーブで滅菌します。非滅菌表面との偶発的な接触の場合には、余分な消耗品を殺菌する。歯垢をガムラインに沿って削り取り、滅菌紙ポイント、グレーシーキュレット、または無菌の爪楊枝またはピペットチップを使用して、MRDまたはPBSなどの適切なバッファーに移します。
さらに進む準備ができるまで、サンプルを氷の上に置いておいてください。小さなピペットチップを使用してボルテックスとピペットの組み合わせを使用して歯垢を激しく再中断し、MRDバッファーの9ミリリットルを含むチューブに再懸濁プラークサンプルを追加します。無菌技術を使用して滅菌フィルターアセンブリを慎重にアンラップします。
4分の1回転を外し、フィルターホルダーを締め直してスレッドが適切に係合され、装置が適切に閉じられていることを確認します。10ミリリットルのMRDバッファーを装置に通し、注射器を使用して膜を洗浄する。洗浄されたフィルターにサンプルを塗布するには、シリンジからプランジャーを取り出し、フィルター装置に取り付けます。
そのフィルター装置の下に無菌遠心分離管を置いて濾液を捕まえ、分散した歯科サンプルを注射器に注ぎ、フィルターに積み込みます。次に、プランジャーに軽い圧力をかけて、サンプルをフィルターに押し込みます。膜を別の10ミリリットルのMRDバッファーで洗浄し、濾過サンプルと同じチューブ内の流れを収集します。
その後、無菌でチューブをキャップし、氷の上に保ちます。チューブとキャップに向きマークを付けて、遠心分離後の細胞ペレットの位置を特定します。上側にマークを付けた高速遠心分離機にチューブを置き、サンプルを摂氏4度で1時間60,000 Gで遠心します。
遠心分離後、上清を慎重に注ぎ、ペレットをチューブの上側に置きます。次に、ボクテクによってMRDバッファーの1〜2ミリリットルでペレットを再懸濁する。適切な成長培地を2ミリリットルずつチューブにアリクォートして培養管を準備します。
次いで、宿主生物の一晩培養200マイクロリットルと、各チューブに再懸濁濾過サンプルの100〜200マイクロリットルを加える。結合サンプルを宿主生物に適した条件下でインキュベートする。200マイクロリットルのバイナリー培養物を新しいチューブ中の新鮮な成長培地の2ミリリットルに移すことによって、2〜3日ごとに細胞を通過させる。
継代行培養物が200マイクロリットルの未感染宿主培養で増殖を示さない場合、細胞を通過させると、接種されたチューブをインキュベーターに戻す。24マイクロリットルのPCRマスターミックスを0.2ミリリットルのPCRチューブに混ぜ合わせます。サッカリバクテリア感染培養液の1マイクロリットルで、チューブをサーモサイクラーに入れます。
テキスト原稿に記載されているとおりにPCRプログラムを設定します。PCR 製品を 1%Agros ゲルでロードして実行します。約600塩基のバンドは、サッカリバクテリアの存在を確認します。
陽性培養物の純度を確認するために、無菌緩衝液中のサッカリバクテリアの共培養物の10倍の連続希釈を行い、寒天板に100マイクロリットルを広げる。適切な成長条件下で培養をインキュベートし、微生物を汚染することを観察する。約600塩基のバンドは、サッカリバクテリアの存在を確認します。
PCR検出は、サッカリバクテリアの共生生物の数が少ないため、初期感染培養において陰性に見えることがある。しかし、数回の経過の後、強いPCR産物が現れ、安定した感染が起こったことを示す。同じ糖菌の濾液を有するいくつかの宿主種を試験すると、通常は成功率が低い。
共生ホストの相互作用は非常に具体的です。感染した培養物が成長するにつれて、正常な濁った成長が現れるはずです。共生が確立するにつれて、感染した培養物は、感染していない宿主生物の培養物よりも濁って見えなくなる。
汚染された培養物は、めっき後に感染したコロニーを摘み取ることによって精製することができる。感染したコロニーは、感染していないコロニーと比較して不規則なコロニー形状によって識別される場合があります。通常のコロニーの割合は、バイナリー培養におけるサッカリバクテリアの火酸に依存する。
価価が低い場合、不規則に見えるコロニーが少なくなり、感染したコロニーを選んで純粋なバイナリー培養を始めるのが簡単になります。文化はいくつかの箇所に陽性に見えないかもしれません。だから、いくつかの患者が必要になります。
また、バイナリ培養の汚染を定期的にチェックする必要があり、これは培養を不安定にし、サッカリバクテリアの死につながる可能性があります。バイナリカルチャは、あらゆる種類の実験室での実験に使用できます。DNAとRNAは、それぞれゲノムシーケンシングとトランスクリプトーム解析のために抽出することができます。
病原性は、動物モデルを用いて調べることもできます。
