Сахарибактерии являются облигатными паразитами, которые требуют совместной культивовки с соответствующими бактериями-хозяевами. Как и пероральные сахарибактерии человека, их можно легко выделить для большинства людей, использующих известные виды бактерий-хозяев. Этот протокол позволит любому исследователю или лаборатории выделить свои собственные штаммы в бинарной кокультуре.
Этот метод использует простые устройства и оборудование, присутствующие в большинстве микробиологических лабораторий, и успешно используется для культивирования более 30 изолятов, представляющих шесть видов сахариактерий. Этот протокол может быть полезен для выделения других видов радиации, за которыми следуют кандидаты, а также сахарибактерий из различных сред и других млекопитающих, если соответствующие актинобактериальные хозяева могут быть идентифицированы и выделены. Продемонстрировать процедуру будет Эндрю Коллинз, бывший постдокторант в моей лаборатории.
Для начала запустите культуры бактерий-хозяев, таких как arachnia propionica, с достаточным количеством времени, чтобы они выросли до ранней стационарной фазы. Чтобы начать культуру, привите от двух до пяти миллилитров триптического соевого бульона, содержащего 0,1% дрожжевого экстракта, с arachnia propionica, и инкубируйте его при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Далее собирают фильтродержатели с вытравленными гусеничными 0,2-микрометровыми фильтрующими мембранами.
Оберните их в фольгу и стерилизуйте автоклавированием вместе с центрифужными трубками и колпачками в сборе. Стерилизуйте дополнительные расходные материалы в случае случайного контакта с нестерильными поверхностями. Соберите зубной налет, соскоблив вдоль линии десен, используя стерильную бумажную точку, изящную кюретку или стерильную зубочистку или наконечник пипетки, и перенесите его в подходящий буфер, такой как MRD или PBS.
Держите образец на льду до тех пор, пока не будете готовы к дальнейшему продолжению. Энергично повторно суспендировать зубной налет, используя комбинацию вихрей и пипетки с небольшим наконечником пипетки, затем добавьте повторно суспендированный образец зубного налета в пробирку, содержащую девять миллилитров буфера MRD. Осторожно развернить стерильный фильтр в сборе с помощью асептической техники.
Раскрутить на четверть оборота, и повторно затянуть фильтродержатель, чтобы убедиться, что резьба правильно задействована, а аппарат правильно закрыт. Промыть мембрану, пропуская 10 миллилитров буфера MRD через аппарат, используя шприц. Чтобы приложить образец к промытой фильтре, извлеките плунжер из шприца и прикрепите его к фильтрующий аппарат.
Поместите стерильную центрифужную трубку под этот фильтрующий аппарат, чтобы уловить фильтрат, затем вылейте диспергированный стоматологический образец в шприц и загрузите его на фильтр. Затем приложите легкое давление к плунжеру, чтобы протолкнуть образец через фильтр. Промыть мембрану еще 10 миллилитрами буфера MRD и собрать поток в той же трубке, что и отфильтрованный образец.
Затем проведите по трубочке и держите на льду. Сделайте ориентировочную отметку на трубке и колпачке, чтобы определить местоположение ячейки гранулы после центрифугирования. Поместите трубку в высокоскоростную центрифугу с отметкой на верхней стороне и центрифугировать образцы при 60 000 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.
После центрифугирования осторожно высыпьте супернатант, удерживая гранулу на верхней стороне трубки. Затем повторно суспендируют гранулу в одном-двух миллилитрах буфера MRD путем энергичного вихря. Готовят культурные трубы путем алицитирования двух миллилитров соответствующей питающей среды в трубы.
Затем добавьте 200 микролитров ночной культуры организмов-хозяев и от 100 до 200 микролитров повторно суспендированного фильтрованного образца в каждую пробирку. Инкубировать комбинированные образцы в условиях, подходящих для организма-хозяина. Пропускают клетки каждые два-три дня путем переноса 200 микролитров бинарной культуры на два миллилитра свежей питательной среды в новой трубке.
Если проходные культуры не показывают роста на 200 микролитрах неинфицированной культуры хозяина, при прохождении клеток возвращают инокулированные трубки в инкубатор. Aliquote 24 микролитра мастер-микса ПЦР в 0,2-миллилитровую ПЦР-трубку. На одном микролитре зараженной сахарибактериями культуры поместите трубку в термоциклер.
Установите программу ПЦР, как описано в тексте рукописи. Загрузите и запустите продукты ПЦР на геле 1% Agros. Полоса из примерно 600 оснований подтвердит наличие сахариобактерий.
Чтобы подтвердить чистоту положительных культур, выполняют 10-кратное серийное разведение кокультуры сахариобактерий в стерильный буфер, и распределяют 100 микролитров на агаровую пластину. Инкубируют культуру в соответствующих условиях роста и наблюдают за загрязняющими организмами. Полоса из примерно 600 оснований подтвердит наличие сахариобактерий.
Обнаружение ПЦР может быть отрицательным в начальных культурах инфекции из-за низкого количества сахариобактерий симбионтов. Однако после нескольких проходов должен появиться сильный продукт ПЦР, свидетельствующий о том, что произошла стабильная инфекция. Тестирование нескольких видов хозяев с одинаковым фильтратом сахарибактерий обычно имеет низкий уровень успеха.
Поскольку симбионтное взаимодействие хозяина очень специфично. По мере роста зараженных культур должен появляться нормальный мутный рост. По мере того, как симбиоз устанавливается, зараженные культуры будут казаться менее мутными, чем культуры неинфицированных организмов-хозяев.
Загрязненную культуру можно очистить, собирая зараженные колонии после покрытия. Инфицированные колонии иногда могут быть идентифицированы по неправильной форме колонии по сравнению с неинфицированными колониями. Пропорция регулярных колоний зависит от титра сахариобактерий в бинарной культуре.
Если титр низкий, меньшее количество колоний будет казаться нерегулярным, что позволяет легко выбрать зараженные колонии и начать чистую бинарную культуру. Культуры могут не казаться положительными для нескольких отрывков. Так что некоторые пациенты понадобятся.
Также необходимо регулярно проверять на загрязнение бинарных культур, так как это может дестабилизировать культуру и привести к гибели сахариобактерий. Бинарная культура может быть использована для всевозможных лабораторных экспериментов. ДНК и РНК могут быть извлечены для секвенирования генома и анализа транскриптома соответственно.
Патогенность также может быть исследована с использованием животных моделей.
