Las sacaribacterias son parásitos obligados que requieren co-cultivo con bacterias huésped apropiadas. Como saccharibacterias orales humanas se pueden aislar fácilmente para la mayoría de los individuos que utilizan especies bacterianas huésped conocidas. Este protocolo permitirá a cualquier investigador o laboratorio aislar sus propias cepas en co-cultivo binario.
Esta técnica utiliza dispositivos y equipos simples presentes en la mayoría de los laboratorios microbiológicos y se ha utilizado con éxito para cultivar más de 30 aislados que representan seis especies de sacaribacterias. Este protocolo puede ser útil para el aislamiento de otras especies de radiación candidatas seguidas, así como de sacaribacterias de diferentes ambientes y otros mamíferos si se pueden identificar y aislar huéspedes actinobacterianos apropiados. Demostrando el procedimiento estará Andrew Collins, un ex becario postdoctoral en mi laboratorio.
Para comenzar, comience los cultivos de bacterias huésped como la aracnia propionica, con tiempo suficiente para que crezcan hasta la fase estacionaria temprana. Para iniciar el cultivo, inocular de dos a cinco mililitros de caldo de soja tríptico que contiene extracto de levadura al 0,1% con aracnia propionica, e incubarlo a 37 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, ensamble los portafiltros con membranas de filtro de 0,2 micrómetros grabadas en orugas.
Envuélvalos en papel de aluminio y esterilice por autoclave, junto con tubos de centrífuga y conjuntos de tapas. Esterilizar suministros adicionales en caso de contacto accidental con superficies no estériles. Recoger la placa dental raspando a lo largo de la línea de las encías, utilizando un punto de papel estéril, curette elegante, o un palillo de dientes estéril o punta de pipeta, y transferirlo a un tampón adecuado como MRD o PBS.
Mantenga la muestra en hielo hasta que esté lista para continuar. Resuspend la placa dental vigorosamente usando una combinación de vórtice y pipeteo con una pequeña punta de pipeta, luego agregue la muestra de placa resuspended a un tubo que contiene nueve mililitros de tampón MRD. Desenvuelva cuidadosamente un conjunto de filtro estéril utilizando la técnica aséptica.
Desenrosque un cuarto de vuelta y vuelva a apretar el soporte del filtro para asegurarse de que las roscas estén correctamente enganchados y que el aparato esté cerrado correctamente. Lave la membrana pasando 10 mililitros de tampón MRD a través del aparato, usando una jeringa. Para aplicar la muestra al filtro lavado, retire el émbolo de una jeringa y conéctelo al aparato filtrante.
Coloque un tubo de centrífuga estéril debajo de ese aparato de filtro para atrapar el filtrado, luego vierta la muestra dental dispersa en la jeringa y cárguela en el filtro. A continuación, aplique presión ligera al émbolo para empujar la muestra a través del filtro. Lave la membrana con otros 10 mililitros de tampón MRD y recoja el flujo en el mismo tubo que la muestra filtrada.
A continuación, tapar el tubo asépticamente, y mantener en el hielo. Haga una marca de orientación en el tubo y la tapa para identificar la ubicación del pellet celular después de la centrifugación. Coloque el tubo en una centrífuga de alta velocidad con la marca en la parte superior y centrifug la muestra a 60, 000 G durante una hora a cuatro grados Centígrados.
Después de la centrifugación, vierta cuidadosamente el sobrenadante, manteniendo el pellet en la parte superior del tubo. A continuación, resuspend el pellet en uno a dos mililitros de tampón MRD por vigorosamente vórtice. Prepare los tubos de cultivo alícuotando dos mililitros de medios de crecimiento apropiados en los tubos.
Luego, agregue 200 microlitros de cultivo nocturno de organismos huéspedes y de 100 a 200 microlitros de muestra filtrada resuspended a cada tubo. Incubar las muestras combinadas en condiciones apropiadas para el organismo huésped. Pase las células cada dos o tres días transfiriendo 200 microlitros del cultivo binario a dos mililitros de medio de crecimiento fresco en un nuevo tubo.
Si los cultivos pasados no muestran crecimiento a 200 microlitros de cultivo huésped no infectado, al pasar las células, devolver los tubos inoculados a la incubadora. Alícuota 24 microlitros de la mezcla maestra de PCR en un tubo de PCR de 0,2 mililitros. En un microlitro de cultivo infectado de sacaribacterias, coloque el tubo en un termocisómetro.
Establezca el programa de PCR como se describe en el manuscrito del texto. Cargue y ejecute los productos de PCR en un gel 1%Agros. Una banda de aproximadamente 600 bases confirmará la presencia de sacaribacterias.
Para confirmar la pureza de los cultivos positivos, realice una dilución en serie de 10 veces del cocultivo de sacaribacterias en un tampón estéril y extienda 100 microlitros en una placa de agar. Incubar el cultivo en condiciones de crecimiento adecuadas y observar si hay organismos contaminantes. Una banda de aproximadamente 600 bases confirmará la presencia de sacaribacterias.
La detección de pcr puede aparecer negativa en las culturas iniciales de la infección debido a un número bajo de simbiontes de las sacaribacterias. Sin embargo, después de algunos pasajes, debe aparecer un producto de PCR fuerte, lo que indica que se ha producido una infección estable. Las pruebas de varias especies hospedadas con el mismo filtrado de sacaribacterias generalmente tendrán una baja tasa de éxito.
Como el simbionte interacción del host es muy específico. A medida que los cultivos infectados crecen, debe aparecer un crecimiento turbio normal. A medida que la simbiosis se establece, los cultivos infectados aparecerán menos turbios que los cultivos de organismos huéspedes no infectados.
Un cultivo contaminado se puede purificar recogiendo colonias infectadas después del revestimiento. Las colonias infectadas a veces se pueden identificar por una forma de colonia irregular en comparación con las colonias no infectadas. La proporción de colonias regulares depende del título de sacaribacterias en el cultivo binario.
Si el título es bajo, menos colonias aparecerán irregulares, lo que facilita la selección de las colonias infectadas y el inicio de un cultivo binario puro. Las culturas pueden no parecer positivas para varios pasajes. Así que algunos pacientes serán necesarios.
También es necesario comprobar regularmente la contaminación de los cultivos binarios, ya que esto puede desestabilizar el cultivo y conducir a la muerte de las sacaribacterias. El cultivo binario se puede utilizar para todo tipo de experimentos de laboratorio. El ADN y el ARN se pueden extraer para la secuenciación del genoma y el análisis del transcriptoma, respectivamente.
La patogenicidad también se puede investigar utilizando modelos animales.
