この方法は、開発中のSARS-コロナウイルス-2ワクチンに関するより重要な質問の1つに答える方法を提供する。ワクチンは中和抗体応答を引き出すことができるか?この手法の主な利点は、格納レベル 2 の施設で行うことができる点です。
また、比較的高速で安価で、一度に多くのサンプルを分析するのに適しています。中和酸手順を実証し、研究室のシニア技術者であるリカルド・マリウスとMD博士課程の学生であるテイラー・ジェイミーソンがいます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で10%FBSを補ったDMEMでベロE6細胞を培養することから始めます。
細胞を通過するには、まずPBSの10ミリリットルを加えて、皿を4〜5回静かに揺らすことでそれらを洗います。PBSを吸引した後、3ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、37°Cでインキュベートする前に表面全体が覆われているように皿を揺らします。細胞が切り離されたら、10%FBSで補ったDMEMの7ミリリットルを加えることによってトリプシンを非アクティブ化し、数回上下にピペットを作って細胞を再中断する。
遠心分離によってトリプシンを除去し、新鮮なDMEMの10ミリリットルで細胞を再懸濁する前に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。計数後、7番目の細胞に約10を各15センチメートルプレートに10回加え、細胞が100%コンフルエントになるまで1〜2日間培養をインキュベートする。VSVスパイクEGFP擬似ウイルスを整えるため、12ミリリットルの無血清DMEMで希釈したストックウイルスに感染する多重度0.01で細胞に感染する。
ウイルスを追加した後、摂氏37度で1時間、時折揺れる5%の二酸化炭素をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、接種を2%FBSおよび20ミリモルヒープで補った新鮮なDMEMに置き換え、摂氏34度と5%の二酸化炭素で24時間培養する。翌日、蛍光顕微鏡を用いて、感染した細胞のEGFP発現を可視化する。
広範な細胞パシー効果と細胞剥離が観察されたら、培養上清を収集し、遠心分離によって破片を除去する。複数の凍結融解サイクルを避けるために、マイナス80°Cで貯蔵する前に上清をアリクォートする。ウイルス性チターを決定するために、ベロE6細胞を6回のウェルプレートに10〜5番目の細胞の6倍の播種密度でプレートし、一晩インキュベートする。
翌日、7つのマイクロ遠心分離管に900マイクロリットルの培地を加え、1番目のチューブに100マイクロリットルのウイルスストックを加えることで、ウイルスストックの10倍のシリアル希釈シリーズを設定しました。短いボルテックスの後、希釈されたウイルスの100マイクロリットルを後続の各チューブに移し、各チューブ間の渦を起分させる。次に、ベロE6培養プレートの各ウェルの上清を、マイナス7のウイルス希釈液に対してマイナス秒から10までの10~10の500マイクロリットルに置き換えます。
細胞培養インキュベーターで45分間のインキュベーションを行い、15分ごとに穏やかに揺れ動いた後、接種液をオーバーレイ溶液に置き換え、34°Cで細胞を5%の二酸化炭素で48時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、結晶紫色染色によってプラークを可視化し、各ウェルに0.1%の結晶紫色の2ミリリットルを加える前にPBSで細胞を1回洗浄する。プレートを室温で約20分間ロッカーに置き、PBSで2回ずつゆっくりと洗います。
最後の洗浄後、プレートが少なくとも1時間空気乾燥してから、示された式を使用して、各ウェルのウイルスの価価をミリリットル当たりのプラーク形成単位で計算するようにします。中和アッセイのために細胞をプレートするには、マルチチャンネルピペットを使用して、1ミリリットル当たり5番目の細胞の2倍から5番目の細胞の密度で96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのベロE6細胞を追加し、37°Cと5%の二酸化炭素でプレートを24時間インキュベートします。翌日、熱は、56°Cの水浴で30分間試験される患者血清サンプルを不活性化する。
その後、空の96ウェル組織培養プレートに患者の血清サンプルの10倍希釈シリーズを設定し、血清の8マイクロリットルを72マイクロリットルの無血清DMEMに加え、各ウェルAの各ウェルに抗生物質を加え、40マイクロリットルの無血清DMEMを行BからG、80マイクロリットルの各ウェルに追加します。 行Aでサンプルを混ぜ、行Aの各ウェルから行Bの各ウェルにサンプルの40マイクロリットルを転送し、混合後、行F.Nextまでウェルの後続の各行に希釈を繰り返し、0.05のVSVスパイクEGFPの40マイクロリットルを0.05の多重性で追加します。 37°Cと5%の二酸化炭素で1時間プレートをインキュベートする前に4〜5回ピペットで混ぜます。インキュベーションの終わりに、Vero E6培養プレートの各ウェルから上澄み物を慎重に吸引し、サンプル希釈板の各ウェルから細胞培養板の対応するウェルに60マイクロリットルの抗体ウイルス混合物を移管する。すべてのサンプルが転送されたら、細胞培養プレートを摂氏37度、20分ごとに揺れ動かしながら1時間5%の二酸化炭素を置きます。
インキュベーションが完了したら、カルボキシメチルセルロースオーバーレイ溶液140マイクロリットルを細胞培養プレートの各ウェルに加え、プレートを摂氏34度と5%の二酸化炭素インキュベーターに移します。24時間後、488ナノメートル波長の自動蛍光イメージャー上のプレートを画像化し、イメージャーの自動計数機能を使用して個々のEGFP病巣を定量化します。本代表例では、SARS-コロナウイルス-2スパイク受容体結合ドメインに対して市販の中和抗体を陽性対照として用いた、IgGと並んで陰性対照として用いた。
阻害率は、蛍光イメージングを介して検出されたEGFP病巣の数に基づいて算出した。SARS-コロナウイルス-2感染後約3ヶ月後に採取された回復期の患者サンプルによる擬似ウイルス中和は、入院を必要としない患者と比較して中和能力の増加を示した。この手順は、ウイルス感染を阻止することを目的とする他のCOVID-19予防および治療剤を評価するためにも使用することができる。
