Este método proporciona una forma de responder a una de las preguntas más importantes relacionadas con las vacunas contra el SARS-coronavirus-2 en desarrollo. ¿Es la vacuna capaz de provocar una respuesta de anticuerpos neutralizantes? La principal ventaja de esta técnica es que se puede hacer en una instalación de contención de nivel dos.
También es relativamente rápido y económico, por lo que es muy adecuado para analizar muchas muestras a la vez. Demostrando el procedimiento de ácido neutralizante, tenemos a Ricardo Marius, un técnico superior en el laboratorio y Taylor Jamieson, un estudiante de doctorado MD. Comience cultivando células Vero E6 en DMEM suplementadas con 10% FBS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Para pasar las células, primero lávelas agregando 10 mililitros de PBS y meciendo suavemente el plato de cuatro a cinco veces. Después de aspirar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina EDTA y balancee el plato para asegurarse de que toda la superficie esté cubierta antes de incubarlo a 37 grados centígrados. Una vez que las células se hayan desprendido, desactive la tripsina agregando siete mililitros de DMEM suplementados con 10% FBS, luego resuspenda las células mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces.
Retire la tripsina por centrifugación y aspire el sobrenadante sin perturbar la bolita celular antes de volver a suspender las células en 10 mililitros de DMEM fresco. Después de contar, agregue aproximadamente una vez 10 a las séptimas células a cada placa de 15 centímetros e incube el cultivo durante uno o dos días hasta que las células sean 100% confluentes. Para preparar el pseudovirus EGFP de pico VSV para la titulación, infecte las células a 0.01 multiplicidad de infección con el virus stock diluido en 12 mililitros de DMEM sin suero.
Después de agregar el virus, incube las células durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con balanceo ocasional. Al final de la incubación, reemplace el inóculo con DMEM fresco suplementado con 2% FBS y 20 montones milimolares, luego incube las células a 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, use un microscopio fluorescente para visualizar la expresión de EGFP de las células infectadas.
Una vez que se observa un efecto ciopático extenso y desprendimiento celular, recoger el sobrenadante de cultivo y eliminar los restos por centrifugación. Para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación, alícuota el sobrenadante antes del almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Para determinar el título viral, platee las células Vero E6 en seis placas de pozo a una densidad de siembra de seis veces 10 a la quinta célula por pozo e incube durante la noche.
Al día siguiente, configure una serie de dilución en serie de diez veces del stock viral agregando 900 microlitros de tubos de microcentrífuga media a siete y agregando 100 microlitros de stock viral al primer tubo. Después de un breve vórtice, transfiera 100 microlitros de virus diluido a cada tubo posterior, vórtice entre cada tubo. Luego reemplace el sobrenadante en cada pozo de la placa de cultivo Vero E6 con 500 microlitros de las diluciones virales de 10 a menos segundo a menos 10 a menos séptimo.
Después de una incubación de 45 minutos en la incubadora de cultivo celular con un balanceo suave cada 15 minutos, reemplace el inóculo con una solución superpuesta e incube las células a 34 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Al final de la incubación, para visualizar las placas por tinción de cristal violeta, lave las células una vez con PBS antes de agregar dos mililitros de violeta de cristal al 0,1% a cada pozo. Coloque la placa en un balancín durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente antes de lavar suavemente cada pozo dos veces con PBS.
Después del último lavado, deje que las placas se sequen al aire durante al menos una hora antes de usar la fórmula indicada para calcular el título del virus en cada pozo en unidades formadoras de placa por mililitro. Para platear las células para un ensayo de neutralización, use una pipeta multicanal para agregar 100 microlitros de células Vero E6 a cada pozo de una placa de 96 pozos a una densidad de dos veces 10 a la quinta celda por mililitro, e incube la placa durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, el calor inactiva las muestras de suero del paciente para ser analizadas en un baño de agua de 56 grados centígrados durante 30 minutos.
Luego configure una serie de dilución de diez veces de las muestras de suero del paciente en una placa de cultivo de tejido vacía de 96 pozos agregando ocho microlitros del suero a 72 microlitros de DMEM sin suero con antibióticos en cada pozo de la fila A.Luego agregue 40 microlitros de DMEM sin suero a cada pozo de las filas B a G y 80 microlitros a cada pozo de la fila H.Usando una pipeta multicanal de 12 pozos, mezclar las muestras en la fila A, luego transferir 40 microlitros de la muestra de cada pozo de la fila A a cada pozo de la fila B.Después de mezclar, repita la dilución para cada fila posterior de pozos hasta la fila F.A continuación, agregue 40 microlitros de ESPIGA VSV EGFP a 0.05 multiplicidad de infección a cada pozo en las filas A a G, y mezclar mediante pipeteo de cuatro a cinco veces antes de incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, aspire cuidadosamente el sobrenadante de cada podo de la placa de cultivo Vero E6 y transfiera 60 microlitros de mezcla de virus de anticuerpos de cada podo de la placa de dilución de la muestra al pozo correspondiente de la placa de cultivo celular. Cuando todas las muestras hayan sido transferidas, coloque la placa de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora con balanceo cada 20 minutos.
Después de completar la incubación, agregue 140 microlitros de solución superpuesta de carboximetilcelulosa a cada podo de la placa de cultivo celular y transfiera la placa a una incubadora de 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, imagine las placas en un generador de imágenes fluorescente automatizado a una longitud de onda de 488 nanómetros y utilice la función de conteo automatizado del generador de imágenes para cuantificar los focos individuales de EGFP. En este ejemplo representativo, se utilizó un anticuerpo neutralizante disponible comercialmente contra el dominio de unión al receptor de picos del SARS-coronavirus-2 como control positivo, junto con IgG como control negativo.
El porcentaje de inhibición se calculó en función del número de focos de EGFP detectados a través de imágenes fluorescentes. La neutralización por pseudovirus por muestras de pacientes convalecientes recolectadas aproximadamente tres meses después de la infección por SARS-coronavirus-2 mostró que los pacientes hospitalizados demostraron una mayor capacidad neutralizante en comparación con aquellos que no requirieron hospitalización. Este procedimiento también se puede utilizar para evaluar otros agentes terapéuticos y de prevención de COVID-19 que tienen como objetivo bloquear la infección viral.
