Este método fornece uma maneira de responder a uma das questões mais importantes relativas às vacinas SARS-coronavirus-2 em desenvolvimento. A vacina é capaz de obter uma resposta neutralizante de anticorpos? A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser feita em uma instalação de contenção nível dois.
Também é relativamente rápido e barato, tornando-o adequado para analisar muitas amostras ao mesmo tempo. Demonstrando o procedimento ácido neutralizante, temos Ricardo Marius, um técnico sênior no laboratório e Taylor Jamieson, um estudante de doutorado em Doutorado. Comece por culminar células Vero E6 em DMEM suplementadas com 10% FBS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para passar as células, primeiro lave-as adicionando 10 mililitros de PBS e balançando suavemente o prato quatro a cinco vezes. Depois de aspirar o PBS, adicione três mililitros de trippsina EDTA e balance o prato para garantir que toda a superfície esteja coberta antes de incuba-la a 37 graus Celsius. Uma vez que as células tenham se destacado, desative a trippsina adicionando sete mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS, em seguida, resuspend as células pipetando para cima e para baixo várias vezes.
Remova a trippsina por centrifugação e aspire o supernatário sem perturbar a pelota celular antes de reutilizar as células em 10 mililitros de DMEM fresco. Após a contagem, adicione aproximadamente uma vez 10 às sete células a cada placa de 15 centímetros e incuba a cultura por um a dois dias até que as células sejam 100% confluentes. Para preparar o pseudovírus EGFP de pico VSV para titering, infecte as células a 0,01 multiplicidade de infecção com o vírus de estoque diluído em 12 mililitros de DMEM sem soro.
Depois de adicionar o vírus, incubar as células por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com balanço ocasional. No final da incubação, substitua o inóculo por DMEM fresco suplementado com 2%FBS e 20 mililitros, em seguida, incubar as células a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, use um microscópio fluorescente para visualizar a expressão EGFP das células infectadas.
Uma vez observado um extenso efeito citopático e o descolamento celular, colete a cultura sobrenatante e remova os detritos por centrifugação. Para evitar vários ciclos de congelamento, aliquot o supernatante antes de armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para determinar o titer viral, as células de placa Vero E6 em seis placas de poço a uma densidade de semeadura de seis vezes 10 para as quintas células por poço e incubam durante a noite.
No dia seguinte, configure uma série de diluição serial dez vezes do estoque viral adicionando 900 microliters de tubos de microcrédito a sete microcrífugas e adicionando 100 microliters de estoque viral ao primeiro tubo. Após um breve vórtice, transfira 100 microliters de vírus diluído para cada tubo subsequente, vórtices entre cada tubo. Em seguida, substitua o supernaente em cada poço da placa de cultura Vero E6 por 500 microliters dos 10 para o menos segundo a 10 para as diluições menos sétima viral.
Após uma incubação de 45 minutos na incubadora de cultura celular com balanço suave a cada 15 minutos, substitua o inóculo por uma solução de sobreposição e incuba as células a 34 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. No final da incubação, para visualizar as placas por coloração violeta cristalina, lave as células uma vez com PBS antes de adicionar dois mililitros de 0,1% de violeta cristalina a cada poço. Coloque a placa em um roqueiro por aproximadamente 20 minutos em temperatura ambiente antes de lavar suavemente cada poço duas vezes com PBS.
Após a última lavagem, deixe as placas secarem pelo menos uma hora antes de usar a fórmula indicada para calcular o título do vírus em cada poço em unidades formadoras de placas por mililitro. Para emplacar células para um ensaio de neutralização, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 microliters de células Vero E6 a cada poço de uma placa de poço de 96 a uma densidade de duas vezes 10 a cinco células por mililitro, e incubar a placa por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, o calor inativa as amostras de soro do paciente a serem testadas em um banho de água de 56 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, configure uma série de diluição dez vezes das amostras de soro do paciente em uma placa vazia de cultura de tecido de 96 poços adicionando oito microliters do soro a 72 microliters de DMEM sem soro com antibióticos em cada bem da linha A.Em seguida, adicione 40 microliters de DMEM sem soro a cada poço de linhas B a G e 80 microliters a cada poço de linha H.Usando uma pipeta multicanal de 12 poços, misturar as amostras na linha A, depois transfira 40 microliters da amostra de cada poço da linha A para cada poço da linha B.Após a mistura, repita a diluição para cada linha subsequente de poços até a linha F.Next, adicione 40 microliters de VSV egFP em 0,05 multiplicidade de infecção para cada poço nas linhas A a G, e misture por pipetar quatro a cinco vezes antes de incubar a placa por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, aspire cuidadosamente o supernaente de cada poço da placa de cultura Vero E6 e transfira 60 microliters de mistura de vírus de anticorpos de cada poço da placa de diluição amostral para o poço correspondente da placa de cultura celular. Quando todas as amostras tiverem sido transferidas, coloque a placa de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora com balanço a cada 20 minutos.
Após a conclusão da incubação, adicione 140 microliters de solução de sobreposição de carboximetilcelulose a cada poço da placa de cultura celular e transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono de 34 graus Celsius e 5%. Após 24 horas, imagem as placas em um imager fluorescente automatizado a 488 comprimentos de onda nanômetros, e use o recurso de contagem automatizada do imager para quantificar os focos EGFP individuais. Neste exemplo representativo, um anticorpo neutralizante comercialmente disponível contra o domínio de ligação do receptor de pico SARS-coronavirus-2 foi usado como um controle positivo, ao lado do IgG como um controle negativo.
A inibição percentual foi calculada com base no número de focos EGFP detectados via imagem fluorescente. A neutralização do pseudovírus por amostras de pacientes convalescentes coletadas aproximadamente três meses após a infecção pelo SARS-coronavírus-2 mostrou que os pacientes hospitalizados demonstraram uma maior capacidade de neutralização em comparação com aqueles que não necessitaram de internação. Este procedimento também pode ser utilizado para avaliar outros agentes de prevenção e terapêutica COVID-19 que visam bloquear a infecção viral.
