私たちのプロトコルは、天然組織に密接に影響を与える3Dバイオエンジニアリングモデルを提供します。これは、神経芽細胞腫の治療と診断のための新しい治療法とバイオマーカーの発見に利用できる可能性があります。主な利点は、バッチ間の一貫性を実現する再現性のある技術を使用して腫瘍微小環境を研究するために、より生理学的に関連する実験条件を作成することです。
私たちの足場法は、第一に神経芽細胞腫の新規治療法を特定するために利用することができ、第二に、個々の患者の反応をより正確に予測するために患者由来の細胞を組み込むために利用することができます。まず、PBSに保存されている足場を層流フードに入れます。滅菌ピンセットを使用して足場をコーナーからそっと持ち上げ、側壁を押して余分なPBSを取り除きます。
次に、光沢のある層を下に向けて、非接着性の24ウェルプレートのウェルの中央に足場を置きます。プレートに細胞株、播種密度、および時点の詳細をラベル付けします。一度に1つの播種密度の細胞を操作し、残りの細胞をインキュベーター内で37°Cに保ちます。
足場への細胞付着については、滅菌チップ付きのP20ピペットを使用して細胞懸濁液を完全に混合し、各足場の中央に20マイクロリットルの関連する細胞懸濁液を加えて、細胞懸濁液がウェルの側壁や底部ではなく、足場の上に残るようにします。細胞を3〜5時間、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で3〜5時間付着させます。インキュベーションの最後に、P1000ピペットを使用して、足場のずれを防ぐために、予熱した増殖培地1ミリリットルを各ウェルにゆっくりと加え、プレートを一晩インキュベートします。
最初は、2〜3日ごとに足場を観察し、細胞が足場内で増殖するにつれて増殖培地の色が変化します。スローモードの10ミリリットルのピペットガンを使用して、使用済みの培地1ミリリットルをウェルから取り出して廃棄します。馴化培地を実験に使用する場合は、使用済みの培地を15ミリリットルの遠心チューブに回収し、遠心分離によって細胞破片をペレット化します。
上澄み液を新しいチューブに移し、マイナス80°Cで保管します。ピペットガンをドリップモードにした後、2ミリリットルの予熱した増殖培地を足場にそっと加えます。骨格含有プレートをインキュベートし、示されているように、所望の増殖期間の間、新鮮な培地を補充する。
層流フードで、0.2マイクロメートルの滅菌フィルターを遠心分離管にろ過することにより、適切な細胞生存率アッセイ試薬を滅菌します。滅菌溶液、完全増殖培地、および滅菌PBSをウォーターバスで摂氏37度に予熱します。滅菌ピンセットを使用して、分析する足場を新しい24ウェルプレートに移し、関連するすべての詳細をプレートにラベル付けします。
予熱した増殖培地900マイクロリットルを各ウェルに加える。次に、100マイクロリットルの無菌細胞生存率試薬を各ウェルに加えます。ネガティブコントロールの場合は、900マイクロリットルの培地と100マイクロリットルの無菌細胞生存率試薬を足場のないウェルに加えます。
プレートの蓋を元に戻し、プレートを約3分間静かに揺らして、希釈した細胞生存率試薬をウェル全体に分配します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%でインキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出した後、プレートを数秒間静かに揺らし、テキスト原稿に示されているようにトリプリケートを生成します。
100マイクロリットルのインキュベート培地と試薬を24ウェルプレートの1ウェルから半透明の96ウェルプレートの1ウェルに移し替えてテクニカルトリプリケートを生成し、このステップを1ウェルに対して合計3回実行します。96ウェルプレートをアルミホイルで覆い、細胞生存率試薬を光から保護します。残りの700マイクロリットルの培地と試薬を24ウェルプレートの足場から取り出し、廃棄します。
各足場を1ミリリットルの滅菌PBSで2回洗浄します。マイクロプレートリーダーを使用して、570ナノメートルと600ナノメートルの吸光度を測定し、メーカーの推奨に従って細胞生存率試薬の減少率を計算します。適切なソフトウェアを使用して、細胞生存率の結果を統計的に解析します。
生物学的三重値を入力してエラーバーを生成し、アッセイのばらつきを示します。適切な生物統計学的ソフトウェアを使用して、実験期間における細胞生存率の変化を調べるために、一元配置分散検定を実行します。テキスト原稿に記載されているように、グラフ上の時点間の有意差を示します。
足場上で増殖させた2つの神経芽腫細胞株、KellyLucおよびIMR32の生存率を評価した。細胞密度の増加により、時間の経過とともに細胞生存率試薬がさらに減少しました。足場から抽出したDNAを定量することで、足場上の細胞増殖を間接的に測定し、サンプルあたりの細胞数を算出した。
IMR32細胞は時間の経過とともに増殖が増加し、次にKellyLuc細胞が増加しました。足場上の細胞の増殖形態と分布は、ヘマトキシリン、エオシン、および免疫組織化学染色によって視覚的に評価されました。KellyCis83細胞は、侵襲性の低いKelly細胞株よりも速く成長し、両方の足場組成物に深く浸透しました。
ナノハイドロキシアパタイト上に成長したIMR32は、14日間にわたって、大きくて密集したクラスターと対照的な成長パターンを示しました。細胞特異的な形質は、免疫組織化学染色、続いてファロイジンおよびDAPI染色によってモニターされ、コラーゲン-グリコサミノグリカンスキャフォールド上のKellyおよびKellyCis83細胞でアクチンの存在量が観察されました。in vitroでの細胞活性評価では、クロモグラニンAの分泌レベルを測定し、コラーゲン-グリコサミノグリカンおよびコラーゲンナノハイドロキシアパタイト足場で増殖した細胞は、従来の2D培養で増殖した細胞と比較して、より多くのクロモグラニンAを産生しました。
化学療法抵抗性のKellyCis83細胞株は、Kelly細胞株よりも多くのクロモグラニンAを分泌しました。細胞接着後、細胞は様々な治療薬で処理することができる。これにより、従来の2D培養よりも、薬物に対する細胞の反応について、より生理学的に関連性のある結果が得られます。
この技術により、研究者は、がん細胞が腫瘍微小環境内でどのように振る舞い、刺激に反応するか(治療への反応や他の細胞タイプとの相互作用など)をよりよく調べることができます。
