著者らは、バイオリアクターやバイオリアクター培養器を開発するために彼の技術的なサポートのために月ハンスマン（フラウンホーファーIGB、シュツットガルト）に感謝したいと思います。

1。 BioVaScの脱細胞化<ol><li>カニューレを挿入し、動脈アクセスおよびPBSで腸管腔経由でブタ空腸セグメントの血管系をすすい- 。それが完全にきれいになるまで繰り返します。 </li><li> 4アダプタと200ミリメートル直径のガラス水槽を準備し、蠕動ポンプ（Ismatec）にシリコンチューブを経由して接続してください。制御部圧力は、無菌使い捨てドーム（ 図1参照）に接続された圧力センサを介して監視することができる。 </li><li>脱細胞化（DZ）溶液とリザーバーボトルを記入し、可能な気泡のための配管システムをチェックします。 </li><li>管腔フロー用のガラスコネクタにケーブルタイで腸管腔を接続します。血管系の赤い動脈アクセスします（ 図1B）に500ミリリットルDZ液ポンプ。全体を手動腸管腔を押してすぐにポンププロセスごとに15分を中断します。 </li><li> decellularizati中に自然に血圧をモデルにした100 mmHgで、 - プロセスに、緩衝液の圧力は80の間でなければなりません。 </li><li> PBSでBioVaScを洗う-それは、細胞残骸から外れるまで（「完全に白」）。 </li><li> DZ液で完全にBioVaScを記入し、それがシェーカーロッキングに4℃で一晩DZ液に沈めインキュベートする。 </li><li>ステップ1.6を​​繰り返します。 </li><li> DNase溶液中BioVaScを置き、シェーカーロッキングに4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> DNase溶液を外し、洗浄緩衝液ですすいでください。 </li><li> 25kGyのγ-殺菌</li></ol> 2。異なる細胞型初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞（低継代数のMVEC）および線維芽細胞の単離2.1 <ol><li> 2の短冊状に皮膚生検（好ましくは包皮）をカット-メスで3mmの幅と、それらをPBSで3回すすいでください-ソリューション。 </li><li>ディスパーゼ溶液で組織をカバーし、16のためにそれを培養する - 14℃で8時間</li><li>独立した2ピンセットで真皮から表皮とは、PBS +で満たさペトリ皿に、両方を別々に転送。 </li><li>リンス真皮はベルセンで1Xを取り除きます。 </li><li>真皮ストリップに10ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を加え、40分間インキュベーター内でインキュベートする。 </li><li> 1％FCSですぐに酵素反応を停止。 </li><li> VascuLifeで満たされたペトリ皿に皮膚ストリップを転送し、それぞれの側8Xメスで、各ストリップを傷、少しの圧力を加える。 </li><li>遠心チューブにセルストレーナーを介して生成細胞懸濁液を転送し、VascuLifeでセルストレーナーの3回すすいでください。 </li><li> 5分間1200×gでチューブを遠心分離し、VascuLifeで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>線維芽細胞を単離するために、チョップ真皮はメスを用いて小さな破片に取り除きます。 </li><li>真皮片をコラゲナーゼ溶液10mlを加える。 </li><li>インキュベーター内で45分間静置してから遠心分離し、慎重にSUを削除pernatant。 </li><li> DMEM +10％のFCS +％PenStrep、遠心分離機それにペレット1Xを洗浄し、慎重に上清を除去します。 </li><li>培養液中にペレットを再懸濁し、細胞が組織の外に成長することができるように、T75培養フラスコに移す。 </li></ol> 2.2腫瘍細胞株S462 （親切に博士ニコラHoltkamp、シャリテ大学医学部ベルリン提供）腫瘍細胞株S462は、遺伝性腫瘍素因症候群神経線維腫症1型9と女性患者の悪性末梢神経鞘腫瘍から生成されました。 S462は、10％FCSを補充したDMEM中で培養する。 3日 - 中は、すべての2に変更する必要があります。週に一度のセルを分割する必要があります。 3。腫瘍試験システム：静的培養条件バイオリアクターシステムの動的な文化との比較<ol><li>管状SIS-MUCが片側に開いて、二つの金属リング（細胞クラウン、直径10mm、自己cの間に固定するカットonstructed）。一晩細胞培養培地中のSIS-MUCをカバーしています。 </li><li> SIS（モノ - もしくは共培養セットアップ）の片面または両面上に定義された細胞数のシード単離された細胞（以下を参照）。 <ol><li>シードSIS（旧漿膜）の基底外側表面に全量100μlの一次低継代数の8,000個/ cm 2。 3時間後に水没文化を確実にするための媒体とよくを埋める。 </li><li>内皮細胞は3日間、接着させる。 180度の静的培養システムを裏返して12ウェルプレートに移す。 </li><li> SIS（旧ルーメン側）の先端面上に500μlの総容積内で一次皮膚線維芽細胞（8,000細胞/ cm 2）及び腫瘍細胞（15,000細胞/ cm 2）の混合物に播種する。 </li><li>細胞は3時間付着し、メディアとうまく埋めるために許可する（沈め文化、中：10％FCSを添加した50％Vasculife +50％のDMEM）。 </li><li>腫瘍試験システムは、静的条件aの条件下で培養されるトン37°C、さらに14日間インキュベーター中5％CO 2。 3日 - 2日毎の培地を変更します。 </li></ol></li><li>ダイナミックな文化のために、2の金属リングとの間で、SIS-MUCを修正し、3.2.1で説明したように、一次低継代数をシード。 3日後の金属リングからSIS-MUCを削除し（ 図2C及び2Dを参照）、フロー反応器内に膜を挿入します。バイオリアクター内でマトリックス上にシリンジおよびカニューレを有する一次皮膚線維芽細胞および腫瘍細胞を適用し、細胞を培地でバイオリアクターシステムを充填する前に、3時間付着させる。 </li><li>翌日、一定の媒体流（3.8 ml /分、37℃及び5％CO 2）を用いて動的培養条件を開始することができる。動的培養物を14日間維持され、培養培地を7日後に変更される。 </li><li>動的テストのセットアップは、ポンプや必要な温度とCO 2を介してメディアフローを提供し、自己構築インキュベーターで培養する</sub&gt;内容。 </li></ol> 4。分析のための特性評価方法 4.1固定及びシードされたコラーゲンマトリックスのパラフィン包埋<ol><li> （免疫）組織学的特徴付けのために、培地を除去し、2時間、4％パラホルムアルデヒドで組織を固定します。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒドを除去して組織包埋カセットに金属インサートからSISを転送します。残りの固定液を除去し、パラフィン浸透のために脱水するために組織を水</li><li>パラフィンブロックに埋め込む前に、2にSISをカット - 3スライスと切断面が下に向くようにパラフィンを充填した金属ベース金型内に配置します。バックアップなどの金型の上に組織カセットを追加します。 </li><li> 5μmのスライスをカットし、矯正のための40℃の水浴上に浮遊し、その後、適切なガラススライド上にスライドをマウントします。コー​​ティングされていないスライドをH＆E汚れの付着を改善するための免疫組織学的染色のためのポリリジン被覆スライドに使用される。スライスは完全に乾燥させます。 </li><li>パラフィンを溶かし、キシレンでそれを削除し、染色を次のスライスを再水和。 </li></ol> 4.2染色<ol><li>再水和スライスは、標準化された概要染色としてのヘマトキシリン​​/エオシンで染色することができる。 </li><li>免疫組織学的染色のために、固定し、パラフィン浸潤組織切片は、抗体が認識し、その特定のエピトープに結合することができるように、抗原回復を受けなければならない。したがって、脱パラフィンし、再水和したスライドを20分間加熱し、クエン酸緩衝液（pH6.0）で蒸気調理器内に配置される。 </li><li>染色溶液のための必要量を最小限にするPAPペンで洗浄緩衝液（0.5 M TBS緩衝液+ 0.5％ツイーン）と円スライスへの転送を摺動する。 </li><li>水分室でスライドを置きます。抗原 - 抗体結合の特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ媒介性の可視化を確保するために、内因性ペルオキシダーゼを3％過酸化水素で飽和されなければならない。 </li><li>原発antibODY希釈は、スライスに適用RTで1時間インキュベートし、注意深く洗浄緩衝液で洗い流す。 </li><li>特定の抗原抗体バインディングの検出用超視覚Quanto検知システム、HRP、DAB（サーモサイエンティフィック）が推奨プロトコルに従って使用されている。 </li><li>核を、1分間ヘマトキシリン​​で対比されている。 </li><li>スライドは、水性媒体を搭載し、乾燥し、逆顕微鏡を用いて撮像される。 </li></ol>

<ol>
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Rev. 63, 195-196 (2011).</li><li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine.">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

<html>腫瘍研究における2Dおよび3D培養系を比較すると、3Dシステムは、より高価なアプローチであるにもかかわらず、良好な生物学的微小環境における条件を模倣することが証明されている。これは、いくつかの腫瘍細胞は、腫瘍内の実際の状況に応じた一般的な2D培養12日よりも3D培養においてはるかに遅く成長することを示すことができた。ビッセルらは発癌性乳癌細胞の挙動をより正確にマトリックス内の3D培養が細胞-ECM相互作用を提供するとき、細胞形態およびシグナル伝達などのin vivoでの状況を反映していることを自分の仕事にあった。さらに、それらは、環境の相互作用の変化が正常な表現型に悪性細胞の復帰につながっていることを実証することによって、3Dで細胞外環境の重要性を強調した。さらに、最も重要なことは、これらの結果はまた、10,11 インビボ動物モデルにおいて確認することができた。 ontent &quot;&gt; in vivo動物実験およびインビトロでの組織モデルでの直接比較は、両方のシステムに利点と欠点を明らかにしている。in vitroモデルの一つの利点は、はるかに優れたリアルタイムまたは顕微鏡による固定撮像の許可である。制限があるそれらは、免疫応答をホスト、 インビボ系しばしば進行のに対し、血管系および小分子の正常な輸送の現在の不足を静的または短期的条件を模倣、及び他の細胞-細胞相互作用は、in vitroモデル12のさらなる欠点であるため、3Dを本研究で提示されvitro系で動物実験に有望な追加を提供しています。彼らは、人間の生物に良い比較を提供するため、実験的な誤解を最小限に抑える。バイオミメティックvivoモデル系では、それゆえ癌および転移性の広がりに依存するどのように勉強し、より関連性の高いとなりますtumorigを規制する微小環境条件にenesis 11。 我々の研究は、SIS-MUCによって提供される3D環境は、共通の2D細胞培養では観察されない複数の腫瘍細胞の様組織の形成、（ 図3Aを参照）をもたらすことを示している。また、腫瘍生検由来の初代細胞の使用は、個別化医療、患者の個々のニーズに応じて、最善の治療を特定することを目的と規律に向けた非常に重要なステップです。生検材料から単離された一次患者特有の腫瘍細胞を組み込むことは、治療戦略のインビトロ試験において可能にする。そのような試験システムにより、時間とコスト削減ハイスループットスクリーニングにおけるその異なる薬剤との組み合わせを調査することであろう。さらに、この研究で示されるように、腫瘍関連間質細胞の集積は、腫瘍の微小環境に影響を与える腫瘍進行13は 、パーソナライズされたアプローチのために重要であると証明するかもしれないようSUITABル·治療標的。 代替的にパーソナライズされたアプローチには、我々の腫瘍モデルを確立し、腫瘍形成性細胞株の取り込みによって一般化された腫瘍試験システムとして機能するように修飾することができる。これは、基本的な研究目的のための有望な適応したものです。薬物検査の両方のために血管構造の存在が治療物質の分布および取り込みをテストするために必要とされて近づく。 SIS-MUC行列がバリア取り込み研究のために、一次MVECと側底播種を可能にする、BioVaScの保存の血管構造の再シードはさらに、薬物送達の研究を改善します。 組織モデルを作成するために、3次元生分解性マトリックスは、異なる細胞型14の共培養のためのフレームワークとして使用することができる。このような3次元マトリックスの使用は、多くの場合、機能的血管新生が存在しないことによって制限される。この問題は、保存血管strを提供BioVaScの使用によって解決することができるuctures、その内皮細胞で再播種することができる。さらに、BioVaScは、細胞の接着性を確保し、組織の分化を促進する細胞外成分を提供する。また、バイオ人工3D組織7,8,15の長年の組織特異的機能を可能にします。機能的血管代替物のエンジニアリングのための前提条件は、人間の生理的および生体力学的条件の模倣である。従って、 インビトロでこれらの要件を実現することができるバイオリアクターシステムは、生物学的な腫瘍モデルを作成するための極端な関心がある。 BioVaScの組み合わせは、バイオリアクター技術および異なる細胞型の共培養は、例えば血管新生および転移などの癌の進行に関連するメカニズムの研究を可能にする血管新生した腫瘍組織を生成するための非常に有望な方法である。我々は同等を提供することで、動物実験を補完するための有望なアプローチとして、腫瘍モデルを見るヒト腫瘍生理機能。

新薬は、その品質、安全性、市場の承認の前に有効性に関して検証する必要があります。現在までに、動物実験は、薬物テストと検証のための標準的な方法である。しかし、種特異的な違いのために、動物実験では、多くの場合、総合的に、人間1の化合物の効果を評価しない。このため、新たな薬剤および物質のin vitro試験のために使用することができるヒト組織モデルを生成することが重要である。 私たちのグループの焦点の一つは、私たちの生物学的に血管新生足場（BioVaSc）2,3 を用いたin vitro試験モデルを作成することです。 BioVaScは、静的または動的3Dマトリックス系として使用することができる。静置培養のために、脱細胞化ブタ空腸のセグメント（小腸粘膜下組織SIS-MUC）は、細胞の再シードに金属インサートに配置されます。例えば、癌細胞および内皮細胞のような種々の細胞は、足場上で培養することができる。 <pダイナミックな文化のためのクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、BioVaScは血管系全体または足場の表面を横切って流れを適用するバイオリアクターシステムに取り付けられている。現在のバイオリアクターは、細胞4の分化や増殖に作用する、生物学的、機械的、または電気的刺激を実施する。組織工学の分野におけるバイオリアクターについては、基本的なコンセプトは、人体内の条件をシミュレートすることである。ここで、細胞は、それらが互いにおよびその周囲の細胞外マトリックスと相互作用することができる自然環境が提供される。 インビトロ試験系または移植片の製造のために、適切なキャリア構造およびバイオリアクターシステムを用いて細胞の自然環境を模倣する能力は重要で5である。そのため、より複雑で技術的に要求のデバイスは、これらのタスク6を満たすために開発されなければならない。 それはestablすぐ足場を使用することも可能である原因栄養動脈、静脈、および接続毛細血管床を含む保存管状構造への血管化モデルのishment。すべてのブタ細胞は、化学的、機械的および酵素的脱細胞、および足場ガンマ線滅菌によって除去する必要がある。復元された管状の血管構造は、その後、例えば、pH、温度、圧力、栄養供給と廃棄物除去6と生体力学的および/ ​​または生化学的パラメータを模倣する再循環灌流バイオリアクター7を用いて、ヒト微小血管内皮細胞で再播種することができる。管状構造の再内皮化は、コラーゲン性足場3,7内で、人間の血管と同等に作成されます。次のステップでは、前者の管腔（粘膜）の表面には、共培養3,7,8を確立するために、初代ヒト細胞を接種することができます。 本研究では、3D腫瘍テストシステムは、原発STと腫瘍細胞株を共培養することで設定されているSIS-MUC上の静的および動的条件下romal細胞。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

がんは、世界中の主要な死亡原因の一つである。現在の治療戦略は、主に不十分なin vivoでの生理的条件を反映した2次元培養系で開発されています。生物学的な3Dマトリックスは、組織の組織および細胞分化の研究を可能にする、細胞に細胞が自己組織化することができる環境を提供する。そのような足場は、直接3D細胞 - 細胞相互作用を研究するために、異なる細胞型の混合物を用いて播種することができる。癌腫瘍の3次元の複雑さを模倣するために、我々のグループは、3D in vitroでの腫瘍のテストシステムを開発しました。 我々の3D組織検査システムモデル我々は、生物学的に血管新生足場（BioVaSc）由来の我々の脱細胞化ブタの空腸セグメントとの間で確立悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNSTs） のin vivoの状況。我々のモデルでは、初代線維芽細胞、微小血管内皮細胞（BioVaScで修飾マトリックスを再播種低継代数のMVEC）およびS462の腫瘍細胞株。静置培養のために、BioVaScの血管構造が除去され、残りの足場は1辺（小腸粘膜下組織SIS-MUC）に切り開かれている。得られたマトリックスは、2つの金属リング（セル冠）との間に固定されている。 別のオプションは、せん断応力に細胞を公開するフローバイオリアクターシステムで培養するために細胞を播種し、SIS-MUCです。ここで、バイオリアクターは、自己構築インキュベーター内蠕動ポンプに接続されている。コンピュータは、例えば、血圧、温度、流量などのパラメータを介して、動脈酸素および栄養の供給を調節する。このセットアップでは、圧力調整拍動または一定流量のいずれかで、動的な文化が可能になります。 本研究では、成功しMPNSTsのための静的および動的な3次元培養システムの両方を確立することができる。より自然な3D環境内癌腫瘍をモデル化する機能を発見、テスト、および検証を可能にします人間のようなモデルでは、将来の医薬品。

図1Bに示すように、我々は毛細血管網の保存管状構造で（長さ及び直径20mmで、約2メートル）ブタの空腸セグメントを脱細胞。化学的、酵素的および機械的な脱細胞化の後、我々は3次元細胞培養に使用することができ、コラーゲンI / III足場を得る。フォイルゲン試験は、マトリックスの純度（無DNAレムナント）（データは示していない）を実証するために実施した。 図2Aおよび2Bは、細胞の冠で固定さSIS-MUCの静置培養を示しています。我々は、動的培養のために、社内に設計されたバイオリアクター（ 図2C）にSIS-MUCを修正しました。 図2Dは ​​、バイオリアクターのチャンバーを通してシミュレートされた動的な流れを示している。バイオリアクターは、自己構築さインキュベーターシステムに入れ、蠕動ポンプに接続されている。このセットアップでは、圧力調整拍動流またはCのいずれかで、動的な文化を可能にする<html> onstant流れ。 図3は、2D単一栽培（ 図3A）および三次元共培養（ 図3B-3D）での静置培養S462の腫瘍細胞株の概要について説明します。 図3Bは、SISの頂端側に腫瘍細胞S462および一次線維芽細胞のトリプル文化を示しています-MUC（旧内部ルーメン側）と側底側のMVEC（旧漿膜側）。異なる細胞型の同定は、MVEC（ 図3C）を標識するために、例えばフォン·ヴィレブランド因子のような細胞型特異的マーカーを染色することによって可能である。 p53の陽性S462細胞は、p53陰性初代線維芽細胞（ 図3D）から区別することができ、細胞の3次元分布を分析することができる。動的培養三重培養の図3を図4染色同等の図 。 <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。脱細胞化のセットアップ。 （A）パソコンで監視BioVaScを脱細胞化するためのバイオリアクター、ポンプセットアップ、（B）脱細胞化BioVaScガラスタンク内。内腔および動脈入口アダプタに接続されている。 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> 図2。異なる培養なセットアップのビュー上に。フローバイオリアクターの上蓋の動的培養のための静置培養のためのマイクロタイターウェルプレート、（B）の金属インサートの静的培養系の（A）のCAD断面図、（C）の媒体流シミュレーション（速度場[M /秒]） 、（D）は蠕動ポンプに接続し、動的培養のためのフローバイオリアクター。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> ENT &quot;FO：キープtogether.withinページを=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> 図3。静的な3D腫瘍モデルの免疫組織学的特性化の概要。パーマスライド上のS462細胞の静置培養2Dモノ文化の（A）ヘマ ​​トキシリン染色、静置培養3Dトリプル文化の（B）、H＆E染色、矢印は、フォンヴィレブランド因子（C）免疫組織染色、（D内皮細胞をマークp53のための）免疫組織染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> <img alt="図4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <st栄&gt;図4。ダイナミックな3D腫瘍モデルの免疫組織学的特性化の概要。 （A）を動的に培養された3Dのトリプル文化のH＆E染色、矢印は内皮細胞、（B）をマークし、フォンヴィレブランド因子に対する免疫組織染色、p53のための（C）の免疫組織染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a>

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場（BioVaSc）、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

21.1K ビュー.  University Hospital Würzburg. 試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場（BioVaSc）、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。 

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Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

生物工学

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

外科用回収、単離と<em&gt;インビトロ</em&gt;組織工学アプリケーションのためのヒト前十字靭帯由来細胞の拡大

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

操作された複合三次元組織<em&gt;インビトロ</em&gt; /<em&gt;インシリコ</em具体的な突然変異背景に薬物の有効性を予測するための&gt;肺腫瘍モデル

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

強制的に垂直 V ベンドとシステム: 弾性体と剛体の長方形型の 3 Dの in Vitro評価

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...