我々の方法は、妊娠および非妊娠動物の子宮組織に存在する異なるリンパ球亜集団の組成および機能的特徴の評価を可能にする。このプロトコルは、タンパク質の表面発現、細胞の生存率、および機能性を維持しながら、子宮リンパ球の単離を可能にする。したがって、後続の用途の範囲に適しています。
実験の開始時の胎児の除去と白血球コレクションは技術的に困難なステップです。それは長い実験であるため、抗体染色ステップに達したら、特に注意と焦点が必要です。まず、妊娠中のC57黒6匹の雌マウスから採取した子宮組織を無菌のシャーレに移し、滅菌器具を使用して組織を取り巻く脂肪を穏やかに取り除き、組織を乾燥させないように注意する。
各移植部位を滅菌器具で解剖して胎児を取り除き、1ミリリットルの回収培地を含む元の5ミリリットルのコレクションチューブに子宮を戻す。はさみを使用して、コレクションチューブ内の組織をミンチし、37°Cの水浴にチューブを置きます。次に、チューブに事前に温めた酵素消化ミックスの3ミリリットルを追加します。
酵素消化活性を高めるために、攪拌で30°Cで30分間インキュベートします。インキュベートが完了した後、チューブをボルテックスし、氷の上に保って酵素活性を阻害し、消化組織を適切に標識された15ミリリットル遠心分離管に移す。5ミリリットルの回収管を合計10ミリリットルの氷冷5ミリモルEDTA PBS溶液でリンスし、残りの組織をすべて採取し、15ミリリットル遠心管に移します。
消化した組織サンプルを400倍G.G.で10分間遠心分離し、ペレットを軽くフリックし、次いで5ミリモルEDTA PBS溶液を温めて10ミリリットルに再懸濁した。細胞の凝集を減らすために、攪拌で摂氏37度でサンプルをインキュベートし、続いて高い渦を10秒間回転させます。非関連組織の細胞塊を除去するには、無菌50ミリリットル遠心管の上に70マイクロメートルのストレーナーを置き、滅菌1ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通して消化した組織をチューブに強制します。
ストレーナーを合計10ミリリットルの冷たいPBSで数回洗浄してすべての細胞を収集し、50ミリリットル遠心管をG.400回G.400回10分間使用します。次に、ピペットのボイを遅い速度で使用し、15ミリリットル遠心管の再懸濁されたペレットに8ミリリットル、コール溶液あたり40%を慎重にオーバーレイします。ピペットはゆっくりと連続的に、15ミリリットルを約45度の角度に保持する。
オーバーレイを邪魔することなく、室温で中加速度と最小の休憩を備えた850倍Gでチューブを20分間遠心します。遠心分離が完了したら、コール層ごとに邪魔することなく、慎重に遠心分離機からチューブを取り外します。次に、コール溶液当たりの2つの界面で白血球のリングを乱すことなく、無菌パスツールピペットを使用して、コール層ごとにトップの0.5〜1ミリリットルを除くすべてを廃棄する。
ピペットに吸い込まれたコール溶液あたりの量を最小限に抑えようとしながら、白血球のリングを慎重に収集し、細胞を新しいラベル付けされた15ミリリットル遠心分離管に移します。10%の熱と活性化FBSを加えた無菌RPMI培地を10ミリリットル加え、G500倍と摂氏4度で5分間遠心します。上清を捨てて赤血球のリシスに進みます。
オプションBを使用して細胞を単離するには、前述のように細胞ストレーナーを通して消化した組織を通過し、細胞懸濁液の結果を遠心分離した後、コールおよびRPMI培地あたり35%の等張性の8ミリリットルでペレットを再懸濁し、細胞を15ミリリットルのチューブに移す。中加速度と最小の休憩で室温で10分間、940倍Gでチューブを遠心分離します。次に、吸引器またはピペット・ヴォイを使用して、10%の熱と活性FBSを添加したRPMI培地の14ミリリットルでペレットを再懸濁する前に、上清を慎重に吸引する。
試料を500倍Gと摂氏4度で再び5分間遠心し、吸引で上清を捨てて赤血球のリシスに進みます。赤血球を溶解するには、1つのX赤血球溶解溶液の3ミリリットルでサンプルを再懸濁し、室温で3分間インキュベートし、その後、10ミリリットルのPBSをサンプルに加えて反応を停止します。上清を捨ててから5分間Gの400倍のチューブを遠心し、PBSを10ミリリットル加えて遠心分離を繰り返す。
10%熱不活化FBSを添加したRPMI培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、滅菌70マイクロメートル細胞ストレーナーを介して細胞内懸濁液中に通過させる。細胞を数えた後、細胞懸濁液の濃度を100マイクロリットルのPBSで1〜200万個の細胞に調整し、染色およびファクの分析に進む。子宮グループ1のILCは、従来のNK細胞、組織常駐NK細胞、および生命と妊娠の間に変化する割合を有するグループ1ICを含む。
これらのサブセットは、まず細胞に光を散乱させる能力を合体させ、次に単一の買い込み可能なCD 45陽性CD 3個の負のCD 19陰性細胞を単離し、次にNK 1.1およびNKP 46陽性であるグループ1のICを同定することによって、フローサイトメトリーを使用して識別することができる。グループ1のIC内では、CD49A陰性のエマが従来のNK細胞である。CD49A陽性Ems陽性細胞は、組織に常駐するNK細胞である。
CD49陽性Ems陰性細胞とは、グループ1個の子宮ICである。抗NKP46および抗NK1.1抗体を用いた脾臓リンパ球および子宮リンパ球の染色は、脾臓リンパ球が子宮の対応物よりも表面上に高い量のNKP 46を発現することを示している。酵素組織解離では、消化媒体に使用される酵素に応じて表面エピトープが変化する可能性があります。
例えば、リベラーTMを使用するとMHC CD49 NKG2A受容体の染色が悪い。しかし、リベラーDHによる消化は、1611抗体クローンによるNKG2A認識を保持する。妊娠8.5日目の子宮組織サンプルに存在するグループ1のICの約6.5%が血液由来である。
血液汚染物質は、フルオロクロムと共役した抗CD45抗体によるインビタル染色を介して除外することができる。タイムミーティングを設定する場合は、マウスが夜行性であることを考慮する必要があります。したがって、夜間に交配が行われるため、午後にはできるだけ遅く設定する必要があります。
また、女性を選択する際には、膣中隔がないことを確認する必要があります。我々は通常、細胞の外側および細胞内の多くのタンパク質を見るために細胞測定分析を流す。また、RNAシーケンシングを含む遺伝子発現を研究するために核酸抽出を行います。
また、機能的アッセイの周りに管理し、子宮内陸性リンパ球細胞の応答を研究しています。
