B.S.S. をサポートするには、NIH グラント (R01 AI076457) とストーニブ ルック大学によって提供される資金。Z.q 値は NIH 支え (K12 GM102778) を付与します。

すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施され、石の小川の大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
メモ: は、手順を実行する前にすべての承認が与えられていることを確認します。
1. ソリューションの準備
<ol><li>
HGPG (HEPES、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン)、100 ×
	<ol>
<li>ミックス 59.6 g HEPES (最終的な 500 mM)、14.6 g L-グルタミン (最終的な 200 mM)、1 × 106 U (2,000 U/mL 最終) ペニシリン、ストレプトマイシン 1 g (2 mg/mL 最終) と 2.5 mg ゲンタマイシン (5 μ g/mL 最終)。追加 RPMI 1640 ~ 500 mL。NaOH を使用して 7.5 pH 調整 (調整する前にバッファーが ph 値約 6.0 の黄色/オレンジ色)。フィルターは、0.45 μ m のフィルターを使用して滅菌します。因数とストア 4 ° C、1 ヶ月、最長 1 年間、-20 ° C で。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEPES 炭酸バッファーは、10 x
	<ol>
<li>
23.8 g HEPES (最終的な 100 mM)、21 g NaHCO3 (最終的な 250 mM) を混合し、1,000 mL に水を追加します。塩酸フィルターで 7.2 pH を調整する 0.45 μ m のフィルターを使用して殺菌します。常温で保存します。PH は、時間の経過と共に変更します。再定期的に pH を調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
メディアを収穫 (〜 1 ボトル/2 マウス)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 1640、25 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (5% 最終)、および 5 mL 100 × HGPG を追加します。4 ° C で最大 6 ヶ月の保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ジチオエリトリトール (DTE) ソリューション (40 mL/小腸)
	<ol>
<li>ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca2+- および Mg2+-無料、50 mL 10 × HEPES 炭酸バッファー、および 50 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (10%)。350 mL H2O および 15.4 mg ジチオエリトリトール/100 mL (最終的な 1 mM) を追加します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
エチレンジアミン edta 溶液 (50 mL/小腸)
	<ol>
<li>ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca2+- および Mg2+-5 mL 100 × HGPG で無料。445 mL H2O を追加 260 μ L 0.5 M の EDTA を追加/100 mL (最終的な 1.3 mM)。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コラゲナーゼの解決 (30 mL/LP)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 追加 50 mL FBS (10 %fbs ファイナル) 5 mL 100 × HPGP、1 mL 0.5 M MgCl2 (最終 1 mM)、および 1 mL 0.5 M CaCl2 (最終 1 mM)。タイプ I (100 U/mL ファイナル)、コラゲナーゼを追加します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
密度勾配 (DG) ソリューション
	<ol>
<li>90 mL DG 原液を混合することによって 1 × DG 原液を準備 (材料の表を参照) を 10 mL 10 × PBS の。4 ° C で滅菌を維持します。</li>
		<li>1 × DG 原液、56 mL RPMI 1640 44 mL を混ぜて 44 %dg ソリューション (8 mL/発想 8 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
		<li>1 × DG 原液、33 mL RPMI 1640 67 mL を混ぜて 67 %dg 溶液 (5 mL/発想 5 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 腸間膜リンパ節、腸、の分離およびパイエル パッチ
<ol><li>炭酸ガス麻酔とセカンダリの頚部転位を使用してマウスを安楽死させます。その裏にマウスを置き、70% エタノールをスプレーします。はさみを使用して正中切開し、皮膚と腹壁腹腔内を公開するを開きます。</li>
	<li>盲腸を検索し、鉗子を使用して盲腸をそっと引き下げます。鉗子を使用して、慎重にチェーンは、コロンが提携した全体の MLN の公開、右に小腸に移動します。 注: 腸のチェーンやリンパ排水であった腸間膜リンパ節の地図には、13が描かれています。</li>
	<li>盲腸に近い、チェーンの下のノードを識別します。その周りに腸間膜/脂肪をつかんで鉗子の別のセットを持つリンパ節の周りから脂肪を tweezing によっては下部から上部の MLN チェーンを削除優しくする鉗子のセットを使用します。</li>
	<li>MLN チェーンを収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに置きます。ペーパー タワーのチェーンをローリングと鉗子の 2 つセットで脂肪を引っ張って腸間膜/脂肪を削除します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの MLN の場所。 注: ノードの (i) 直接操作は推奨されません。代わりに、それらの周りの腸間膜/脂肪を把握します。(ii) 細胞生存率を改善するために可能な限り多くの腸間膜/脂肪を削除するが重要です。</li>
	<li>幽門括約筋の下とはさみを使って盲腸上小腸をカットします。腸を引き出しますゆっくり回腸から十二指腸鉗子の別のセットを使用して接続されている腸間膜/脂肪を除去しながら 1 組の鉗子を使用します。</li>
	<li>収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに腸を置き、鉗子の 2 つのセットをオフ任意の残りの腸間膜/脂肪をいじめます。 注: (i) は最適な細胞収量および実行可能性のために、できるだけ多くの腸間膜/脂肪を除去することを確認します。(ii) 収穫メディアを定期的に適用することによってこの手順と次の手順で湿らせた腸を維持します。</li>
	<li>曲線はさみで腸からそれらを削除することによって、パイエル板を収集します。解離性のスコープまたは虫眼鏡 (初心者) を必要な場合使用します。パイエル板のほとんどは訓練された目に見えるはずです。小腸から 5 11 (典型的な) パイエルを収集します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの場所 Peyer のパッチ。 注: Peyer のパッチが小さく、主に丸腸間膜付着線向かい外側腸壁の膨らみ。</li>
	<li>糞便のコンテンツ、粘液を追放するのに回腸に向けて十二指腸から鉗子と優しくスライドの平らな側面を使用します。一度粘液の大部分を削除する手順を繰り返します。 注: 粘液の削除が不完全する細胞生存率が低下し、降伏。それにもかかわらず、必ず腸絨毛をストリッピングや基底膜の損傷を避けるためにゆっくりスライドしてください。</li>
	<li>高級はさみを使用し一点に鈍い端腸に鈍い端を挿入し、腸を縦十二指腸から回腸までオープン カットします。横方向に ~ 2 cm 開いた腸を切る。25 mL 冷たい収穫メディア分離手順については後で 50 mL の円錐管で腸の作品を配置します。 注: メディアで湿らせたはさみを維持に役立ちます腸で楽々 スライドします。</li>
</ol>3. 誘導サイトからリンパ球の分離
<ol><li>3 mL シリンジのプランジャーを使用して 70 μ m セル ストレーナーにどう優しく MLN リンパ球を分離します。5 ml の冷たい収穫メディアのセル ストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット MLN 細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。 注: 赤い血セル換散バッファーは削除中に出血した場合、赤色の血液細胞を削除する使用できます。</li>
	<li>37 ° C で 30 分間 220 rpm prewarmed 5 mL コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管にパイエル板の孵化によって、パイエル板のリンパ球を分離します。</li>
	<li>15 の渦最大設定でフィルター s 消化組織及び上澄み 50 mL の円錐管に 70 μ m セル ストレーナー。優しく 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して、冷たい収穫メディアの 5 mL のセル ストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によってパイエル パッチ細胞をペレットし、1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。 注: Peyer のパッチ分離いくつかの汚染の粘膜固有層リンパ球および上皮間リンパ球があります。</li>
</ol>4. 小腸上皮間リンパ球の分離
<ol><li>10 回チューブを反転し、解決、腸の部分をさせる、上澄みを離れて注ぐ冷たい収穫メディア 25 mL で 3 回小腸の部分を洗います。 注: 組織の部分はチューブの底に容易に解決すべき。そうでない場合あまりにも多くの腸間膜/脂肪が添付されているか、空気の泡を関連付けられている指標です。</li>
	<li>腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL のシリル エルレンマイヤー フラスコに転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。</li>
	<li>渦で最大に設定 10 s. 転送清新しい 50 mL の円錐管に元管内組織部分を保つように注意しながら 70 μ m セル ストレーナー管。の上清を廃棄しないでください上清には、上皮間リンパ球が含まれています。4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞10 mL の冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します、氷保存できます。</li>
	<li>腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL シリコーン エルレンマイヤー フラスコに戻って転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。 注: DTE は上皮間リンパ球を豊かにする還元剤です。</li>
	<li>渦で最大に設定 10 s. 転送清 70 μ m セル ストレーナー (ステップ 4.3) から最初の DTE 治療上清から細胞を含む前のチューブにチューブ。 注: 残りの腸管部分、粘膜からリンパ球を分離する使用されます。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に上皮細胞が存在し、基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で上清を遠心分離によって細胞をペレット室温 (RT) で 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。RT 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。ブレーキを使用せず室温で 20 分間 1600 × g で遠心分離機します。 注: チューブは細胞が管壁に付着するを防ぐためにウシ血清前処理した可能性があります。</li>
	<li>生菌が 44% から 67% 界面バンド (バフィー コート) を結成、死んだ細胞といくつかの上皮細胞は、グラデーションの上部に粘液状のフィルムと赤の血液細胞は、ペレットに注意してください。真空吸引によりインターフェイスの ~ 2 cm 以内へのグラデーションの最上位のレイヤーを削除します。パスツール ピペットを使用して、インターフェイスでバフィー コートを収穫し、40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管にそれらを転送します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。</li>
</ol>5. 小腸粘膜固有層リンパ球の分離
<ol><li>残りの腸の部分を含むフラスコに prewarmed EDTA 溶液の 25 mL を追加することによって腸の組織片から上皮細胞を削除します。37 ° C で 30 分のマグネチックスターラー 220 速回転撹拌フラスコは、攪拌棒を保持し、フラスコ内の腸の部分を維持しながら上澄みを慎重に廃棄フラスコの外に大きな磁石を使用します。 注: (i) EDTA はカルシウム依存性接合をターゲット、腸管上皮細胞の剥離を促進するカルシウムのキレート剤です。(ii)、上清は曇りであるべきし、自分のコレクションが必要な場合は、IEC を分離するために使用可能性があります。</li>
	<li>5.1 のステップを繰り返します。 注: 上清は少ない曇りこの培養に続くはずです。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に腸上皮細胞を削除されている基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。上清からのサンプルも確認するフローサイトメトリーによって評価されるその白血球 (CD45+細胞) が存在しません。</li>
	<li>RT 収穫メディアの 50 mL をフラスコに追加します。磁石で簡単にかき混ぜます。腸管部分を解決し、慎重に上澄みを廃棄しなさい 注: この手順により、コラゲナーゼの消化力の前に EDTA の除去、EDTA は、コラゲナーゼの機能にとって重要なカルシウムをキレートでコラゲナーゼを不活性化します。</li>
	<li>フラスコに prewarmed コラゲナーゼ溶液 30 mL を加え、マグネチックスターラー 45 分に 37 ° C および 220 rpm で腸の部分をかき混ぜます。</li>
	<li>転送は、70 μ m セル ストレーナー フィルタ リングによって組織し、50 mL コニカル チューブに上清を消化しました。軽くフィルターをマッシュ アップする 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して考えます。10 ml の冷たい収穫メディアのフィルターを洗います。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞周囲温度 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。周囲温度 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。常温、1600 × g 20 分でないブレーキとグラデーションを遠心します。</li>
	<li>真空吸引により上に脂肪の層を削除します。パスツール ピペットを使用して、インタ フェースと 40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管に転送でバフィー コートを収穫します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

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誘導 (MLN と PP)、腸内から粘膜のリンパ球の隔離のため詳細なプロトコルを提示とエフェクター (LP、IEL コンパートメント) サイト。プロトコルが (時間) の入力と出力 (生存率と収量) の生産性と成果を最大化するバランスを開発しました。プロトコルはまた LP と IEL のコンパートメント間の最小限のコンパートメント クロスコンタミネーションを保証します。
マウス小腸...

胃腸 (GI) 地域には多くのひだや突起内部の体と外部環境を分離する最大のインターフェイスを表す。腸管の免疫系は、消化管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。それは常に食物抗原、共生細菌と病原微生物にさらされます。そのため、それは急速に急性胃腸炎起因微生物1効果的な免疫応答を生成する能力を維持しながらの食物抗原と共生細菌への耐性に残らなければなりません。腸管免疫系誘導サイト、ナイーブ リンパ球は抗原提示細胞が腸の粘膜から抗原を運ぶがアクティブ化されている、およびエフェクター サイト、活性化リンパ球出す特定に解剖学的分類できます。エフェクター機能2。誘導サイトは、調査専門の M 細胞と地域の排水腸間膜リンパ節 (MLN) の作用により直接腸管パイエル板 (PP) のリンパ組織構造を構成します。エフェクター サイトは基底膜と小腸上皮、上皮間リンパ球 (IEL) を含む基底膜上にある単一の細胞層の下の結合組織である粘膜 (LP) から成っています。リンパ球が、感染症や癌に対する保護を仲介し、炎症性疾患の免疫病理学にまた貢献するかもしれない適応免疫の主要なプレーヤーです。それは重要でありこれらの明瞭なリンパ球の研究に関連性の高いより良い粘膜局所理解の誘導とエフェクター機能。
腸内免疫事象を探る捜査官の数を加速するいると、これらのコンパートメントからのリンパ球の隔離のための比較的シンプルで統一されたプロトコルが必要です。いくつかの研究グループがマウス小さい腸内コンパートメント3,4,5,6,7 から免疫細胞を分離することにいくつかの類似のプロセスを共有プロトコルを公開しています。.ただし、個々 のプロトコルの焦点に応じてそれらの間でいくつかの技術的な違いがあります。たとえば、LP から免疫細胞を孤立させることにフォーカスを 1 つのプロトコルは細胞生存率、細胞表面マーカーの発現と分離免疫細胞5の構成に関するさまざまな酵素の消化力の影響を調べます。他のプロトコルは、密度遠心分離6なくリンパ球の隔離のための迅速かつ再現性のある方法を強調表示します。最後に、特定のプロトコルは、小腸7の異なったティッシュ層から単核食細胞を分離する目的も存在します。ここでは、小腸の MLN PP LP、IEL のコンパートメントからリンパ球集団の連続分離ができる再現性の高いプロトコルが表示されます。
我々 は主無料その他の腸の仕切りからの汚染物質の LP と IEL のコンパートメントから高純度の人口を隔離するのに焦点を当てます。これは広くプロトコル生成に許容可能な時間の制約4,8,9,10、11,12内で最大限に純粋な実行可能なリンパ球の高収率を使用しました。このプロトコルはまたこれらの異なるコンパートメントにリンパ球を勉強する善意の機会をできるように最小限の交差コンパートメント汚染と LP と IEL コンパートメントからのリンパ球の分離を保証します。分離されたリンパ球は、フローサイトメトリーによる解析や機能解析のようなそれ以上の操作を受けることができます。このプロトコルが正常にリンパ球の分離にマウス小腸と大腸から中に適用されたリステリア菌、サルモネラ、エルシニア ペスチスなど細菌感染症感染症や化学物質、病原体誘発大腸炎などの炎症性条件。このプロトコルは、樹状細胞、マクロファージ、好中球と単球マウス小腸結腸からなどの自然免疫系細胞を分離するも使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

腸管の免疫系は、急性胃腸炎起因する効果的な免疫応答をマウントしながらレスポンス食物抗原と共生細菌の耐性を生成することによって、腸管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。微生物。さらに、ローカルの腸管免疫では、遠いと全身の免疫力の深遠な影響が明らかになった。そのため、腸内の免疫応答を誘導する方法と、免疫応答の結果を研究することが重要です。腸管関連リンパ組織パイエルとドレインの腸間膜リンパ節のような小腸誘導サイトと粘膜のようなエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルの説明ここと腸上皮。この手法は、最適な純度と生存率と許容可能な時間制約の中での最低限のコンパートメント クロスコンタミネーション多数小さい腸組織からのリンパ球の分離を保証します。リンパ球および小腸組織から他の免疫細胞を分離する技術力により、消化器感染症、癌、炎症性疾患に対する免疫応答の理解。

プロトコルの概略図が描かれている (図 1)。腸粘膜誘導とエフェクターのサイト内にあるリンパ球がはっきりと整理されています。Peyer のパッチ (PP) および腸間膜リンパ節 (MLN) を含むよく組織化された T 細胞領域と B 細胞濾胞リンパ腸上皮に分布よりびまん性リンパ球が含まれています。粘膜 (LP) には、分散びまん性リンパ球とリンパ球分離リ?...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルについて述べると、小さな腸管免疫系の腸上皮は。

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.3K ビュー.  Stony Brook University. 腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルについて述べると、小さな腸管免疫系の腸上皮は。

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An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

の寄生蜂の紹介<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;と抗寄生虫免疫応答

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

免疫・感染学

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

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