この方法により、心筋梗塞後の心臓修復における心臓とその内容物を取り囲む心膜腔の役割を評価することができます。心筋梗塞をモデル化するための従来の冠動脈結紮法と比較して、私たちの方法は無傷の心膜腔を維持し、心虚血損傷後の内容物の決定とその役割の追跡を可能にします。心膜腔の寄与と心臓の損傷反応を理解することは、心膜を標的にして心臓の治癒を改善する治療戦略への重要な洞察を提供します。
麻酔後の開始から始めて、マウスの足を拘束し、手術台に置きます。原稿に記載されているようにマウスを手術用に準備した後、市販の人工呼吸器を使用してキャリアガスとして2%イソフルランと100%酸素でマウスを換気します。次に、毎分110回の呼吸速度、250マイクロリットルの一回換気量、および4ミリメートルの水銀柱の正の呼気圧を設定します。
マウスを右側に30%回転させて、胸の左側を手術用に配置します。次に、胸部の皮膚を2〜3センチ横切開して、左側の胸筋を視覚化します。正中線から外側に1センチの切開を行い、大胸筋と小胸筋を切断します。
出血している血管の焼灼を通して過度の出血を避けてください。3番目と4番目の肋骨の間の肋間筋を視覚化します。左肋間筋を2センチ切開して胸腔に空気を導入し、心臓と肺を切開から離します。
出血せずに肋間を切開するには、人工呼吸器を一時的に停止し、焼灼装置を使用して開口部を広げます。開創器を使用して、肋骨を引っ込めて心臓を露出させます。次に、心膜とその下にある心臓を実体顕微鏡で観察します。
心膜の表面に鉗子をそっと置き、心膜とその下にある心臓の動きを減らします。左付属器の下に出現したLAD冠状動脈を視覚的にランドマーク化します。マイクロニードルドライバーを使用して、LADの下の心膜に適切な縫合糸を導きます。
LADと心膜の反対側に出現する縫合糸を観察します。永久結紮モデルを表し、縫合糸を結び、冠状動脈を通る血流を制限し、左心室の前部の白化を見えるようにします。それからハサミの助けを借りて余分な縫合糸を整えます。
手術後72時間、12時間ごとに鎮痛剤の維持注射を皮下投与します。.イソフルランを1%に減らした後、酸素で換気を維持しながらイソフルランをオフにする。動物が呼吸の兆候を示したら、23ゲージの気管チューブを口から取り外し、マウスを回復ケージに入れて呼吸の再開を監視します。
ケージの一部を加温パッドに置き、マウスをケージ内で回復させて、外部熱源を提供します。切開部と動物の不快感を評価することにより、マウスの健康状態を7日間毎日監視します。必要に応じて、侵襲的手術後の回復を成功させるために抗生物質を投与します。
マウスを酸素で全身麻酔下に維持した後、マウスを加熱ステージプラットフォーム上で仰臥位に置き、足をECGリードに取り付けます。それから胸をこすります。トランスデューサープローブとコンタクトゲルを使用してECG画像を取得し、適切なソフトウェアで分析します。
非侵襲的ECG評価後、イソフルランをオフにし、マウスをケージに戻す。心臓を10%ホルマリンで少なくとも24時間固定します。まっすぐなかみそりの刃を使用して、右心室、心室中隔、左心室を通してサンプルを切り取り、切開が梗塞ゾーンの中心を通過するようにします。
そして、パラフィンは組織サンプルを埋め込みます。次に、切断されたセクションを取り付けカセットに入れて、さらにパラフィンを埋め込み、その後5マイクロメートルの厚さのセクションに分割します。組織切片をスライドに配置した後、トルエンと等級アルコール洗浄を使用して脱パラフィンし、脱イオン水で洗い流します。
その後、水分補給します。次に、ピクリン酸で0.1%シリウスレッドで切片を室温で2時間染色します。切片を0.5%酢酸で3分間洗浄した後、70%エタノールで1分間すすぎます。
顕微鏡評価のためにマウントする前に、エタノール濃度を上げて段階的な洗浄の逆の順序を使用してセクションを脱水します。修正冠動脈結紮術による心筋梗塞誘発の成功は、心臓の機能パラメータと構造的特徴を調べることによって評価されました。機能については、心筋梗塞後3〜4週間以内に心エコー検査により左心室駆出率の低下を評価しました。
組織学的染色により、機能変化は左心室壁の有意な線維化を伴うことが示され、梗塞後4週間で心臓断面のピクロシリウス赤色染色線維症を破綻または無傷の心膜冠動脈結紮モデルで定量することによりさらに確認されました。蛍光ビーズ標識法とフローサイトメトリー解析を組み合わせることで、常駐型Gata6陽性心膜マクロファージを追跡するためのアプローチが得られました。重要なことに、心臓または血液中の標識はほとんどまたはまったく検出されなかった。
心筋梗塞に続いて、細胞の再配置はフローサイトメトリーおよびイメージングによって追跡することができる。心筋梗塞の有無にかかわらず蛍光ビーズ標識心膜骨髄系細胞の定量が示されている。処置中に薄い心膜を誤って破壊または引き裂くのを防ぐために注意が必要です。
この方法は、細胞またはエフェクター遮断を追跡する系統と組み合わせることができ、これにより、梗塞した心臓の治癒反応に対する心膜成分の影響を追跡および決定することができます。我々は、心膜腔が損傷後の心臓を保護し、これは部分的に常在する心膜マクロファージによって媒介されることを同定した。このアプローチは、循環器疾患の新しい研究領域を開きます。
