The authors would like to thank John Kristensen and S&#248;ren Braad Andersen from the Department of Communication, Aarhus University Hospital, Denmark, for their exceptional help with filming and editing. Animal technician Diana Gyldenl&#248;ve and veterinarian Birgitte Kousgaard, Institute of Clinical Medicine Aarhus University Hospital, Denmark for assisting with animal care. This study was supported by the Lundbeck Foundation, the Laerdal Foundation for Acute Medicine, Central Denmark Region&#8217;s Research Foundation, Augustinus Foundation, Aase and Ejnar Danielsens Foundation, the Institute of Clinical Medicine Aarhus University Hospital, Br&#248;drene Hartmanns Foundation, Karen Elise Jensens Foundation, Fonden til L&#230;gevidenskabens Fremme, and Marie Dorthea og Holger From, Haderslevs Fond.

本プロトコルは、デンマークの動物実験検査官によって承認されました。すべての試験動物は、手順全体で麻酔しました。このプロトコルの再生は国家の倫理と動物福祉のガイドラインに従って行われ、地元の倫理委員会によって承認されなければなりません。 1.動物<ol><li> 2000グラム - 約1,500の重量を量るデンマークランドレースの子豚&lt;24時間古いです。 </li></ol> 2.麻酔とメンテナンス流体<ol><li>生理食塩水、プロポフォール（5ミリグラム/ kg）を、フェンタニル（10μgの/ kg）を、およびプロカインのベンジルペニシリンとセボフルラン投与用のマスク、アルコール綿棒、末梢静脈カテーテル、ゴムバンド、注射器：麻酔のために必要な機器（ 図1）を準備（15,000 IU / kg）を。 </li><li>呼吸マスクを介して1〜2％のセボフルランを提供することにより、麻酔を誘導します。 <ol><li>眼瞼と撤退REFLのために評価することによって麻酔の深さを評価しますEXEファイル。子豚が深く麻酔されていることをすると、特定の、経皮的に耳静脈に末梢静脈カテーテルを挿入します。 </li><li>末梢静脈カテーテルの開存性を確認するために、滅菌0.9％生理食塩水1〜2mlのでカテーテルをフラッシュします。プロポフォール（5mg / kg）およびフェンタニル（10μgの/ kg）をボーラス注射を管理します。ボーラス注射投与に続いて0.9％滅菌生理食塩水を1〜2mlの用いた静脈内カテーテルをもう一度フラッシュします。 </li><li>二つの別々のシリンジ注入ポンプでプロポフォール（10 mg / mlの）とフェンタニル（10μg/ ml）で置きシリンジ。静脈内カテーテルに接続されている単一のラインに注入を接合する三方活栓に2つのシリンジポンプから静脈管を接続します。連続静脈プロポフォールの注入（4-12 / kg /時間）とフェンタニル（10μgの/ kg /時間）を起動します。連続注入が実行されると、プロポフォールとフェンタニルのさらなるボーラス注射を与えていません。 </li><li>セボフルランガスanestの投与を中止hesia。 </li><li>抗生物質の予防のための局所的なガイドラインに従って、皮下または筋肉内にプロカインベンジルペニシリン（15,000 IU / kgで）注入します。毎日繰り返します。ビデオは、子ブタに筋肉内投与と比較した場合、より高い血漿濃度およびより長い半減期をもたらすことが示されている皮下投与を示しています。 </li><li>目の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤軟膏を適用します。ポケット状の開口部を形成するために、静かに下まぶたを下に引き出します。内ポケット軟膏の少量を絞ります。閉じる目は軟膏を配布します。毎時乾燥度をチェックし、必要に応じて再適用します。 </li><li> 5％デキストロース/ 10ミリリットル/ kg /時間で0.45％のNaCl IVの連続速度の注入を開始します。中および低酸素後に5ミリリットル/ kg /時間の速度を低下させます。 2~10ミリモル/ Lの間の血中グルコースレベルを維持するために注入速度を調整します。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig1.jpg" /> Figu麻酔および挿管1.機器再。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 3.挿管と換気<ol><li>オープニングのために筋弛緩、ロープスリング（ 図1に示すように円を形成するために一緒に同じ4ミリメートルナイロンロープの両端を結ぶ）するため臭化ロクロニウム（1ミリグラム/ kg）を：挿管のために必要な機器（ 図1）を準備口、綿（3.0ミリメートル、2.5ミリメートル、2.0ミリメートルのサイズ）、キシロカインスプレー（100 mg / mlの）、ストレート刃でカフを有する様々なサイズの気管内チューブを綿棒や獣医の喉頭鏡を傾け、500ミリリットル自己膨張バッグ（バッグバルブ換気、カフの膨張、および聴診器2 mlシリンジ用）マスク。 </li><li>以下の手順で挿管： <ol><li>ストレート喉頭PASを確保するために、各側から首を支持する仰臥位で子豚を配置挿管用のセージ。 </li><li>胸骨ノッチ（典型的には約13センチ）に鼻の先端から測定することによって、気管内チューブの長さを推定します。 </li><li> （下向きに）上顎の周りにロープスリングを置き、開いた口を維持するために上向きに下顎と舌を保持します。 </li><li>筋弛緩を誘発するために臭化ロクロニウム（1ミリグラム/ kg）を静脈内投与します。 </li><li>上向きに舌を持ち上げるために喉頭鏡を使用します。 </li><li>食道に後方に曲がったか、軟口蓋の後ろにキャッチすることができるいずれかの子豚の長い喉頭蓋を、解放するために綿棒をひっくり返した綿を使用してください。 </li><li>披裂軟骨と声帯の完全なビューを可能に舌根に対して持ち上げ喉頭蓋を維持するために喉頭鏡を進めます。 </li><li>喉頭痙攣を防止するために、喉頭で局所的キシロカインスプレー（100 mg / mlの）を適用します。 </li><li>声帯を通して気管内チューブを進めます。狭い気管軟骨の通過を補助するために回転運動を使用してください。アドバンス管アコ予め測定された距離にrding、手動換気のための自己膨張バッグ（バッグバルブマスク）に接続します。キシロカインスプレーで気管内チューブの遠位1/3に噴霧挿管中の摩擦を軽減します。 </li><li>正しい気管内チューブの配置を確認するには、次の両方の肺への二国間の空気入口のリスニング胸をausculate、呼吸困難の兆候のための観察、視覚的に気管内チューブの近位側面に凝縮の存在を確認し、呼気終末炭素の存在を確認比色二酸化炭素検出器を備えた、または利用可能な場合、人工呼吸器の呼気CO 2読み取りにより二酸化。正常終末呼気二酸化炭素は約5％です。正常に見える波形と一緒に2％以上の値は、気管内チューブを気管内にあることを確認します。 </li><li>誤嚥を防ぐために、気管内チューブカフを膨らませます。カフ膨張圧力は、虚血性損傷を避けるために、25未満センチH 2 Oであるべきです<html>周囲組織へ。代わりに、気管内チューブを保持し、チューブの周りのテープ片を巻き、顎を閉じて所定の位置にチューブを固定するために鼻の周りにテーピング続け​​ます。ゆっくりそれが所定の位置に留まることを確実にするために、チューブを引っ張ります。 </li><li>人工呼吸器に気管内チューブを接続します。 </li></ol></li><li>人工呼吸器の設定を調整します。音量制御換気、一回換気量（TV）：10ミリリットル/キログラム[または最大吸気圧（PIP）圧力制御換気で15 cm]で。呼気終末陽圧（PEEP）さ：5 cm。 I：E比1：2。呼吸数：35（4.5〜5.5キロパスカルの間に呼吸終期CO 2を維持するような速度を調整）。 </li></ol> 4.監視と体液サンプリング<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig2.jpg" /> 監視のため2.機器図。ANK &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <ol><li>粘着テープ、滅菌潤滑剤、連続直腸温度測定用プローブ、心電図（ECG）電極、パルスオキシメータ、かみそり、およびEEG電極（ 図2）を監視するために必要な機器を準備します。 <ol><li>後肢の上に置いて飽和プローブ、直腸温度プローブを潤滑し、直腸に6センチメートルを挿入し、38.5から39°Cの生理的レベルでの直腸温度を維持するためのオーバーヘッド放射ヒーターおよび/または加熱された膨張可能なエアマットレスを置き、場所ECG電極。 </li><li>皮下注射針のEEG電極の配置は1センチ×1センチメートルの領域を剃るためにうつ伏せに子豚を配置。各耳の前の一つであり、ちょうど目の背後に正中線での参照電極。針電極を皮下に挿入し、アルコール綿棒で電極部位を清掃してください。仰向けPOに粘着テープと戻り子豚との安全な電極ジション。 </li><li> aEEGモニタの電源をオンにします。 注：EEG統合振幅は上下の余白との密なトレースから構成されています。このモデルでは、下部と上部の余白は、典型的には、乳児に見られるよりも高い場合が多い15〜50μVです。低酸素状態の間、それは注意することが重要である、ECGからのアーチファクトが誤ってaEEGトレースを高めることができます。ボーラス薬（プロポフォールやフェンタニル）は、一過aEEGトレースを抑制することができる、可能な場合、実験中に避けるべきです。薬物および臨床事象の投与はaEEGトレースの解釈を容易にするためにマークされる必要があります。 </li></ol></li><li>滅菌手袋、滅菌ドレープ、メス、アルコール綿棒、無菌ワイプ、臍帯静脈カテーテル（5 FR）、臍動脈カテーテル（3.5神父：中央動脈血圧監視および血液サンプリング（ 図3）のための臍帯カテーテルを配置するために必要な機器を準備します）、縫合鉗子で設定し、湾曲したマイクロ鉗子、はさみ、針ホルダと縫合糸（例えば 、サイズ3-0）、透明接着剤パッチ、血液採取のために5ミリリットル注射器。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig3.jpg" /> 臍帯ラインと血液採取のため3.機器を図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <ol start="3"><li>へその周りの領域を殺菌し、ドレープ。できるだけ皮膚に近い臍帯を切断するためにメスを使用してください。これは麻酔をかけ子豚で臍帯血管を公開しない場合には、血管を露出させるために2ミリメートル臍帯の下に臍の皮膚を切りました。二つの小さな臍動脈と1より大きい臍帯静脈（ 図4）を特定します。 </li><li>動脈（ 図4）を拡張し、臍動脈カテーテルを挿入するために湾曲したマイクロピンセットを使用して（3.5 FR）。 3×体重（kg）を+ 10（剖検の腎動脈の上に下行大動脈に正しい配置に基づいて、実験式）のCMで推定挿入長。 </li><li> 5センチメートル臍帯静脈（ 図4）に第5 Frのカテーテルを配置します。返血により血管内カテーテルの配置を確認してください。臍の周りに巾着縫合を配置することにより、カテーテルを固定し、縫合糸は臍カテーテルの周囲終了し、結び目を作る渡します。透明接着剤ドレッシングカテーテルをカバーしています。 </li><li>予め指定された時点で血液サンプルを収集します。45分の低酸素侮辱4）低酸素発作後2時間の終わりに低酸素侮辱3）に1）直ちに低酸素前、2）30分。血液試料を実験のために他の時点の目的に応じて選択することができます。 </li><li>低酸素虚血（表1）に起因する血液ガスの変化を確認するために、低酸素の間採取した血液試料から動脈血ガス分析を使用します。子豚は、低ヘモグロビンAを持っていることに注意してください（8グラム/ dLの周り）のt誕生と頻繁な採血から貧血になることがあります。 24時間以内にドローあたり2ml未満の血液/ kg体重未満、5ミリリットルの血液/ kg体重を撤回し、血液採取のために地元のガイドラインに準拠しています。貧血の兆候が減少ヘマトクリットおよび頻脈を含みます。 </li><li>動脈内血圧モニタリング（MABP）を継続するためのモニターに動脈ラインを接続します。流体および薬物投与のための静脈ラインを使用してください。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig4.jpg" /> 図4.臍帯血管。臍帯静脈（右）と2つの臍動脈（左）の一つ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 5.低酸素<ol><li>監視を完了した後60分を待ちます。 4％O 2へ切り替えることにより、低酸素を誘導</suB&gt; / 96％N 2のガス混合物。密接に重要なパラメータとaEEGを監視し、45分間低酸素状態を継続します。 </li><li> aEEGトレースは（上マージン&lt;7μV）フラットになると、吸入酸素分画（のFiO 2）を変化させることによって、酸素を調整し、 図5に示すフローチャートに従ってフラットトレースaEEGを維持し、最高のFiO 2レベルに気道内圧を意味します。少なくとも10分間、および低血圧および虚血を確実にするために、下のFiO 2必要に応じてベースラインの70％未満にMABPを目指します。低血圧のレベルは、以前に記載の関連する低酸素性虚血性脳損傷を生成するために、他19,13,30によって示されています。 </li><li>次のように重度の低血圧（MABP &lt;25ミリメートルHgの）の場合、段階的に処理する：簡単に、1〜5％のFiOによって2を増加させる生理食塩水ボーラス（10ミリリットル/ kg）を、ドーパミンの点滴（5-20μgの/ kg /分）およびノルアドレナリンの注入（20 NG-を1μg/ kg /分）。 </li><li> &gt; 10分（間代性、強直O持続発作の場合にはRミオクローヌス発作、一般的に限局またはaEEG振幅の急激な変化によって示されるように）（）次の注射に進む前に30分を可能にして段階的に処理する：フェノバルビタールを静脈の遅いボーラスを20mg / kgを、フェノバルビタール静脈の20mg / kgのを繰り返し、ミダゾラムIVは0.5mg / kgです。 <ol><li>発作が開発し、薬物療法の安楽死に無反応である場合に表示されます。 </li></ol></li></ol><img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig5.jpg" /> 図5.低酸素性虚血フローチャート。フローチャートはaEEGの応答に応じて酸素の調整（F I O 2およびP AW）を示します。平均気道内圧（PのAW）は、（下のRRは下のP AWを与える）PIP / TVを変更する（下位PIPは、下部のP AWを与える）と呼吸数を調整しました。トレースの対象とaEEG =上部余白&lt;5μVおよびトレースの下縁&gt; 3μV（平均4μV）。ターゲット心拍数（HR）=&gt; 80ターゲットは、平均動脈圧（MABP）= MABP&gt; 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 6. 72時間の生存<ol><li>低酸素侮辱後に密接に子豚を監視し、徐々にプロポフォールとフェンタニルの点滴の速度を低下させます。動物が自発的に呼吸している時点で抜管。 </li><li>生存期間中、集中治療およびモニタリングに訓練を受けた者が24時間時計で動物施設で子豚を保ちます。静脈グルコース点滴を20ミリリットルの管理/毎時2-3キロ。低酸素虚血部分ボトルの給餌後に26から48時間後に開始することができます。咽頭反射が存在しない場合、気管と肺への吸引は、ボトル送りによって発生することがあります。 </li><li>実験に関連する場合、ソレセンらによって開発されたスコアリングシステムを使用して、神経学的状態を評価する。で説明初版発行17で詳細。 </li></ol> 7.アウトカム評価<ol><li> 72時間後、セクション2および3に記載されるようにMunkeby ら 31など2で説明したように、MRIは、関連する撮像モダリティでスキャンを実行再び麻酔および換気。 </li><li>実験の最後に（5グラム/ kg、静脈内）ペントバルビタールの致死量で子豚を安楽死させます。 </li><li>実験の目的に応じて検査のために、脳を準備します。 <ol><li>ホルマリン固定組織の脳組織学のために：ロバートソンによって記載されているようにら切開が続き、パラホルムアルデヒドで定着後、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を使用2、Chakkarapani ら 1またはLiu ら 18または脳を削除します。。アンドレらによって記載されているように、4％パラホルムアルデヒド中に浸す。32 </li><li>スナップ凍結組織（ 例えば 、RNAを必要とする分析のため解析または酵素活性アッセイ33）：対象の脳領域を解剖、脳を除去し、スナップ凍結最大1センチメートルの組織ブロックを液体窒素中でのx 1センチメートルMunkeby らによって記載されているように33 </li></ol></li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resuscitation+with+21+or+100%+oxygen+in+hypoxic+nicotine-pretreated+newborn+piglets:+possible+neuroprotective+effects+of+nicotine.">Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine.</a> Neonatology. 93, 36-44 (2008).</li><li>Karlsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+hypothermia+as+selective+head+cooling+or+whole+body+cooling+does+not+protect+brain+or+body+in+newborn+pig+subjected+to+hypoxia-ischemia.">Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia.</a> Pediatric research. 64, 74-78 (2008).</li><li>Kovacs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asphyxia-induced+release+of+alpha-melanocyte-stimulating+hormone+in+newborn+pigs.">Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs.</a> Peptides. 22, 1049-1053 (2001).</li><li>Varvarousi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asphyxial+cardiac+arrest,+resuscitation+and+neurological+outcome+in+a+Landrace/Large-White+swine+model.">Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model.</a> Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).</li><li>Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+tyrosine+hydroxylase+in+the+striatum+of+newborn+piglets+in+response+to+hypocapnic+hypoxia.">Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia.</a> Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).</li><li>Cote, A., Barter, J., Meehan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+metabolic+effects+of+repeated+hypoxemia+in+piglets.">Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets.</a> Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).</li><li>Tichauer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+severity+of+perinatal+hypoxia-ischemia+in+piglets+using+near-infrared+spectroscopy+to+measure+the+cerebral+metabolic+rate+of+oxygen.">Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen.</a> Pediatric research. 65, 301-306 (2009).</li><li>Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+regimen+effects+on+a+pediatric+porcine+model+of+asphyxial+arrest.">Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest.</a> Resuscitation. 35, 69-75 (1997).</li><li>Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+offers+stable+haemodynamics+independent+of+induced+hypothermia+after+hypoxia-ischaemia+in+newborn+pigs.">Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs.</a> Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).</li><li>Munkeby, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+piglet+model+for+detection+of+hypoxic-ischemic+brain+injury+with+magnetic+resonance+imaging.">A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging.</a> Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).</li><li>Andresen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+piglets+exposed+to+hypoxia+after+nicotine+or+saline+pretreatment:+long-term+effects+on+brain+and+heart.">Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).</li><li>Munkeby, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resuscitation+with+100%+O2+increases+cerebral+injury+in+hypoxemic+piglets.">Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets.</a> Pediatric research. 56, 783-790 (2004).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

、その複雑さのために、記述されたモデルは、認定施設において実施することができ、動物の研究において経験します。地元の倫理委員会による承認は、実験開始前に取得する必要があり、最適な動物福祉は常に保証されなければなりません。モデルは、試験動物の生存に基づいているように、無菌環境での感染を防ぐために侵襲的処置の間、維持することが重要です。 <p class="jove_content...

周産期仮死は、低酸素性虚血性脳症（HIE）に伴う急性、しばしば予測できない状態です。このプロトコルの全体的な目標は、周産期の低酸素性虚血性脳症の子豚の生存モデルを実証することです。このモデルは、新生児の脳に、実験神経病理、磁気共鳴イメージング及び分光法に治療（MRIおよびMRS）と、血液、脳脊髄液および尿などの体液中のバイオマーカーの低酸素虚血の様々な程度の効果を調査するために使用することができ。モデルはまた、世界的な低酸素性虚血に影響を受けているのすべては心血管系、呼吸器系、腎臓および肝臓を、調査するのに有用であることが証明されました。 周産期仮死が損なわ酸素供給分娩のまたは即時産後期間で結果です。分娩低酸素イベントは、世界中066万死亡、毎年、世界で2.9ミルの約四分の一を占めます2012年3における新生児死亡をイオン。2010年には115万の赤ちゃんは、出生時仮死4以下の新生児脳症を開発したと推定されました。妊娠34週後に生まれた乳児に脳症のように定義されたHIEは、先進国および発展途上国4 8.5 / 1,000出生まで1-3 /千出生5で発生します。死亡リスクは10〜60％であり、生存者30から100までパーセント6,7における神経学的ハンディキャップのリスク。 5020万障害調整生存年数（DALYs）が分娩低酸素イベント4に起因しています。現在、HIEのための支援以外の唯一の治療は低酸素後低体温です。このように、診断手順と治療戦略の進歩は、HIE 8の管理を改善することが不可欠です。 周産期仮死と新生児の脳損傷の管理後の予後の改善は、基礎疾患メカニズムの知識を拡大するに基づいていますD可能な治療。異なる臨床イベントがHIEにつながる可能性があり、任意の単一の出産センターでの発生率が低い5であるとしてHIEの動物モデルは、特に有用です。新たな予後および診断ツールおよび治療戦略をテストする場合、生物学的変動の影響を最小限に抑えることが可能な実験装置は、不可欠です。動物モデルは、このように誘導された損傷および疾患it&#39;s結果9に関与する動的なプロセスの基礎となる病理学的メカニズムの理解に貢献し、可能な限り厳密に臨床状況に近づける必要があります。新生児のHIEの動物モデルは、齧歯類、ラム、およびブタなどの種の数を、含まれています。比較では、生まれたばかりの子豚は、配信11,12時の大きさに対して、心血管系10と脳の成熟度と人間の新生児に対して高い類似性を有しています。子豚モデルにおける監視、計測および結果の評価はTHAに似ていますHIEの乳児の臨床ケアに使用されるT。したがって、このモデルから新生児ケアへの翻訳の高度があります。 周産期の低酸素症とHIEの子豚のモデルは、多くのグループによって使用され、領域13の数が変化しています。実験の目的に応じて、細心の注意は、薬の選択に低酸素虚血、発作の持続期間と重症度を制御する方法であって、後の侮辱の蘇生とケア、およびアウトカム評価を誘導する方法を支払わなければなりません。バイアスを避けるために、ランダム化試験のデザインは常に介入の研究に使用されるべきです。 低酸素性虚血性損傷を誘導する際に適用される方法が重​​要です。 HIEにつながるグローバル低酸素症は、多くの場合、脳、心臓、肺、腎臓および肝臓を含む多臓器不全をもたらします。評価結果に応じて、HIEのモデルは、局所虚血、 例えばに頼るのではなく、グローバルな低酸素症および虚血に基づくべきである。、車を連結することによってotid動脈14。 &gt; 40ミリメートルHgの2平均動脈血圧を維持しながら、最近の論文では、低酸素症（のFiO 2 12％）と頚動脈圧縮の組み合わせを適用しました。別のグループは、負の塩基過剰&gt; 20ミリモル/ Lまでの8％O 2によってグローバル低酸素症を誘発したり、動脈血圧（MABP）&lt;15ミリメートルHgのを意味し、4時間15で動物を犠牲にしました。低酸素症は、心臓出力によって滴定された、MABP（ベースラインの30〜40％）と動脈血のpH（6.95から7.05）16（30〜35ミリメートルHgまで）。 このレポートに表示されるものと同様のaEEG抑制により滴定グローバル低酸素虚血のモデルは、電気生理学的、臨床的である脳症を実証し、窒息用語の乳児17,18に見られる状態に神経病理学的に匹敵しています。 誘導されたHIEの程度は必要不可欠です。 HIEの有用な動物モデルは、新しいDIAのテストのために許可する必要がありますグノーシス主義手順や治療法の選択肢。これを可能にするために、モデルは、新しい治療法を評価する際にあまり関係であろうほとんど、あるいは全く治療の可能性を伴う重度の脳損傷などの治療可能性がある中程度のHIEを誘導するはずです。低酸素に対する耐性は、試験動物の間でかなり変化します。以前の研究は、より一貫性の脳損傷を達成することができることを示しており、より多くの動物は、振幅統合脳波（aEEG）によって評価し、それぞれの子ブタの脳応答に従って誘発される低酸素症の個別化ではなく、全体集合のFiO 2値を用いて17,19に耐えること低酸素性イベント。 aEEG抑制の持続時間は、いくつかの組織病理学的変化45分aEEG抑制&lt;20分aEEG抑制および重度の発作がで増加&gt;で、脳損傷の程度に相関します。 HIEのための神経保護治療の最近のレビューは、行動結果のMEASを可能にする生存モデルの必要性を確認し動物モデル20でURES。 提示HIEの子豚のモデルの多くの利点があります。これは、結果は人間の生理に変換可能性が高い種に基づいています。 aEEGによるグローバル低酸素性虚血モデル多臓器不全や低酸素虚血の滴定は、バイオマーカーは、MRIや行動が関連する時間点で評価することができるように、生存の臨床関連の転帰と脳損傷の一貫した度を誘導します。 周産期仮死とHIEのピグレットモデルはHIEの病態生理に現在の洞察力に大きく貢献しただけでなく、成功し、最終的にヒトでの新しい治療法で、その結果、臨床試験を先行しています。ピグレットモデル研究は、HIE 21の治療として低体温を確立する上で重要な役割を果たし、および新生児蘇生研究22で使用されています。窒息とHIE、AN内の研究を行う際に、様々なグループが子豚のモデルを使用していましたD研究は低体温23、α-メラニン細胞刺激ホルモン24、心停止25、チロシンヒドロキシラーゼ活性26、反復低酸素暴露27、NMDA受容体活性14を含み、近赤外分光法28。 手続きの過程で微調整があまりにも軽度または厳しすぎる脳損傷29,2のいずれかになることがあり、このレポートに表示される子豚HIEモデルは、で動作するように技術的に困難です。我々は、既存の文献は、以前に発行されたモデルを再現するために十分な詳細を欠いていたことがわかりました。そこで、ここではHIEの研究のためのこの高度なモデルを確立するために研究者を可能にする、このレポートの子豚72時間生存モデルの確立のために必要な技術的な手順の各ステップを示しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Warm-touch-pediatric blanket</td>
			<td style="width:211px;">Covidien</td>
			<td style="width:176px;">5030840</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesive Apertrue Drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>915447</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Utility Drape (sterile) 75x80 cm</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>800530</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neoflon</td>
			<td>BD - Luer</td>
			<td>391350</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Laryngoscope</td>
			<td style="width:211px;">Miller</td>
			<td style="width:176px;">85-0045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endotracheal tube 2.5 mm&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>111-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endotracheal tube 3.0 mm with cuff</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>MM61110030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endotracheal tube 3.5 mm with cuff</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>MM61110035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Anesthesia machine</td>
			<td style="width:211px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:176px;">1009-9002-000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode</td>
			<td>Cephalon</td>
			<td>ACCE120550</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECG - electrodes</td>
			<td>medtronic</td>
			<td>3010107-003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECG-electrodes for MR</td>
			<td>philips</td>
			<td>ACCE120550</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Arterial blood sampler - aspirator</td>
			<td>Radiometer medical ApS</td>
			<td>956552</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8888160341</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8888160333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture set (size 3-0)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8886 623341</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Spinal needle 0.7x38mm</td>
			<td>BD needles</td>
			<td>405254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen</td>
			<td style="width:211px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:176px;">made on order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">NeuroMonitor (CFM) system</td>
			<td>Natus Medical Incorporated</td>
			<td>OBM70002</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy

低酸素性虚血性脳症（HIE）を引き起こす出生時仮死は、全世界で066万死亡、毎年、世界で290万新生児死亡の約四分の一を占めています。 HIEの動物モデルは、HIEにおける病態生理の理解に貢献した、とによる周産期仮死に脳損傷で発生する動的なプロセスを強調しています。したがって、動物試験は、ポスト侮辱の治療戦略のための時間窓を示唆しています。低体温はpdigletモデルのHIEの治療薬としてテストされ、その後、臨床試験で有効であることが証明されました。モデルのバリエーションは、補助的、神経を保護する方法の研究に応用されているとキセノンとメラトニンの子豚の研究は、臨床段階にIとIIの試験1,2をリードしてきました。子豚のHIEモデルは、さらに新生児resuscitation-と血行動態研究のためだけでなく、細胞レベルでの脳低酸素の調査で使用されています。しかし、それは技術的に困難であり、プロトコルでモデルおよび変形があまりにも軽度または厳しすぎる脳損傷のいずれかになることがあります。本稿では、新生児のHIEの安定した子豚のモデルを確立するために必要な技術的な手順を示しています。まず、新生児子豚（&lt;24時間古い、中央値量1500 g）を、麻酔し、挿管し、新生児集中治療室で見られるものと同等の設定で監視されています。グローバル低酸素虚血は、グローバル低酸素症、低血圧を介して虚血および脳の低酸素症を示す平坦なトレース振幅集積EEG（aEEG）を達成するために、吸気の酸素割合を低下させることにより誘導されます。生存aEEG応答および血圧に応じて酸素供給を調整することによって促進されます。脳損傷は、72時間後に組織病理学および磁気共鳴イメージングによって定量化されます。

誘導された侮辱の間に起こる脳の低酸素性虚血の影響がaEEGトレースを記録することによって文書化されています。代表aEEGトレースは、図6に示されています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig6.jpg" /> 図6.代表aEEGトレース。による低酸素性虚血に低振幅。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig6large.jp...

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A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデル

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

a-piglet-model-of-neonatal-hypoxic-ischemic-encephalopathy

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K ビュー.  Institute of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital. Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. 

ビデオ: A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

新生児仮死の新型モデル

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

医学

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the age of 50, yet it is the least understood and studied chronic pelvic pain disorder. A significant subset of patients with chronic pelvic pain report having experienced early life stress or abuse, which can markedly affect the functioning and regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Mast cell activation, which has been shown to be increased in both urine and expressed prostatic secretions of CP/CPPS patients, is partially regulated by downstream activation of the HPA axis. Neonatal maternal separation (NMS) has been used for over two decades to study the outcomes of early life stress in rodent models, including changes in the HPA axis and visceral sensitivity. Here we provide a detailed protocol for using NMS as a preclinical model of CP/CPPS in male C57BL/6 mice. We describe the methodology for performing NMS, assessing perigenital mechanical allodynia, and histological evidence of mast cell activation. We also provide evidence that early psychological stress can have long-lasting effects on the male urogenital system in mice.

We are measuring perigenital mechanical sensitivity and mast cell activation in the prostate of male C57BL/6 mice that underwent an early life stress paradigm &#8211; neonatal maternal separation, in order to induce a preclinical model of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.

新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

脳性麻痺の新生児マウスモデルにおける運動テストのバッテリー

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

新生児マウスの心筋梗塞、心臓再生のモデル

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Use of a Piglet Model for the Study of Anesthetic-induced Developmental Neurotoxicity (AIDN): A Translational Neuroscience Approach

Anesthesia cannot be avoided in many cases when surgery is required, particularly in children. Recent investigations in animals have raised concerns that anesthesia exposure may lead to neuronal apoptosis, known as anesthesia-induced developmental neurotoxicity (AIDN). Furthermore, some clinical studies in children have suggested that anesthesia exposure may lead to neurodevelopmental deficits later in life. Nonetheless, an ideal animal model for preclinical study has yet to be developed. The neonatal piglet represents a valuable model for preclinical study, as they share a striking number of developmental similarities with humans.
The anatomy and physiology of piglets allow for implementation of rigorous human perioperative conditions in both survival and non-survival procedures. Femoral artery catheterization allows for close monitoring, thus enabling prompt correction of any deviation of the piglet's vital signs and chemistries. In addition, there are multiple developmental similarities between piglets and human neonates. The techniques required to use piglets for experimentation will require experience to master. A pediatric anesthesiologist is a critical member of the investigative team. We describe, in a general sense, the appropriate use of a piglet model for neurodevelopmental study.

Use of a Piglet Model for the Study of Anesthetic-induced Developmental Neurotoxicity AIDN: A Translational Neuroscience Approach

Anesthesia-induced developmental neurotoxicity (AIDN) research has focused on rodents, which are not broadly applicable to humans. Non-human primate models are more relevant, but are cost-prohibitive and difficult to use for experimentation. The piglet, in contrast, is a clinically relevant, practical animal model ideal for the study of anesthetic neurotoxicity.

麻酔誘発性発達神経毒（AIDN）研究のための子豚モデルの使用：翻訳神経科学的アプローチ

Anesthesia cannot be avoided in many cases when surgery is required, particularly in children.  Recent investigations in animals have raised concerns that ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

壊死性腸炎の新生児BALB/cマウスモデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

エンテロイド由来単分子膜を用いた早産小腸障害および治癒の in vitro モデルに対するヒアルロン酸35 kDaの効果

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...